趙　琪，汪溪潔，王淑顏，馬　璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價(jià)研究中心，上海　201203)

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基于人胚胎干細(xì)胞的實(shí)時(shí)細(xì)胞系統(tǒng)評價(jià)心臟毒性方法的建立

趙琪，汪溪潔，王淑顏，馬璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價(jià)研究中心，上海201203)

中國圖書分類號: R322．11; R329．24; R329．411; R965．1; R917

摘要:目的采用人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞( human embryonic stem cells derived cardiomyocytes，hESC-CM)聯(lián)合實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)( real-time cell analysis Cardio，RTCA Cardio)，建立一種體外藥物心臟毒性早期篩選方法。方法

將hESC-CM接種到RTCA Cardio E-Plate 96孔板，分析心肌細(xì)胞的搏動頻率、幅度和搏動節(jié)律不規(guī)則性指數(shù)確定細(xì)胞最佳接種密度及檢測時(shí)間，建立體外藥物心臟毒性早期篩選方法。在此基礎(chǔ)上，分別采用0．1 % DMSO作為溶劑對照及具有抗心律失常作用的藥物奎尼丁( 0. 2、0. 78、3. 13、12. 5、50和100 μmol·L－1)作為陽性對照進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果0. 1 %DMSO對hESC-CM的生長指數(shù)( cell index，CI值)、搏動特征圖譜及搏動頻率和幅度均無影響。而與溶劑對照組相比，奎尼丁濃度≥3. 13 μmol·L－1時(shí)影響細(xì)胞CI值和特征性搏動圖譜，抑制細(xì)胞搏動頻率和幅度，且具有濃度依賴性，濃度越高細(xì)胞搏動信號恢復(fù)所需時(shí)間越長，對搏動頻率和幅度的抑制作用越明顯。結(jié)論采用hESC-CM聯(lián)合RTCA Cardio系統(tǒng)建立的體外藥物心臟毒性早期篩選方法可以檢測出奎尼丁對心肌細(xì)胞搏動狀況的影響，該方法可作為一種高通量篩選工具用于臨床前藥物心臟毒性早期篩選。

關(guān)鍵詞:hESC-CM; RTCA Cardio;心臟毒性;藥物;體外篩選;奎尼丁

馬璟( 1963－)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:藥物毒理學(xué)，通訊作者，E-mail: jma@ ncdser．com

心臟毒性在新藥研發(fā)、審批和上市銷售過程中是一個(gè)非常重要的關(guān)注點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，45%的藥物上市后因心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)而撤市，27%的新藥因心血管毒性在臨床前安全性評價(jià)階段被迫終止研發(fā)［1］。因此，提高藥物早期心臟毒性篩選的預(yù)測能力可以大大降低制藥公司研發(fā)成本，提高新藥研發(fā)成功率。目前，常用的藥物心臟毒性體外評價(jià)模型如原代心肌細(xì)胞、類心肌細(xì)胞系等通常存在難以獲取、缺乏自然心肌細(xì)胞環(huán)境中的復(fù)雜通道相互作用以及種屬差異等缺點(diǎn)。缺少能夠準(zhǔn)確模擬人類生理反應(yīng)的低成本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统蔀橄拗扑幬镌缙谛呐K毒性篩選研究的主要原因之一。近年來，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞成為心臟毒性體外評價(jià)研究的新熱點(diǎn)。

胚胎干細(xì)胞衍生于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始外胚層的細(xì)胞，具有自我更新、無限增殖和多向分化的特性。2001年，Kehat等［2］首次將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，開啟了hESC-CM在藥物心臟毒性研究領(lǐng)域的新篇章。hESC-CM的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及電生理特性與正常人心肌細(xì)胞極為相似，是一種非常理想的心臟毒性體外評價(jià)模型。研究表明hESC-CM模型的對藥物性心律失常的預(yù)測能力在定性和定量兩個(gè)方面都可取代兔浦肯野纖維束模型，而且與犬的浦肯野纖維束模型相比，hESC-CM模型對引起動作電位改變的多離子通道阻滯劑所致心律失常的敏感性更高［3－4］。采用hESC-CM模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究不僅可以減少動物使用，縮短實(shí)驗(yàn)周期，降低研發(fā)成本，同時(shí)避免了種屬差異，提高了臨床預(yù)測準(zhǔn)確性。本研究將hESC-CM接種到RTCA Cardio EPlate 96孔板上，建立了基于人胚胎干細(xì)胞和實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)的體外藥物心臟毒性早期篩選方法，并采用0. 1% DMSO作為溶劑對照和具有抗心律失常作用藥物奎尼丁作為陽性對照對該方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1　材料與方法

1．1主要試劑奎尼丁，批號: BCBB6721V，購自美國Sigma公司;胎牛血清、明膠和B27因子購自美國Sigma公司; RPMI 1640培養(yǎng)基和PBS購自美國Gibco公司;乙醇和二甲亞砜( dimethyl sulfoxide，DMSO)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; Y10因子由北京生物物理所友情提供。

1．2主要儀器設(shè)備xCELLigence Cardio細(xì)胞功能分析儀，美國ACEA Biosciences公司; AE100精密天平，美國Mettler Toledo公司; ESC01CLM-170A-B二氧化碳培養(yǎng)箱; ST16R臺式離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司;生物安全柜，上海瑞仰凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司; 8道電動移液器，德國Eppendorf公司。

1．3RTCA Cardio系統(tǒng)基線的測定及細(xì)胞接種hESCCM(馬躍課題組，胚胎干細(xì)胞H7改造后的細(xì)胞系誘導(dǎo)分化d 30的心室肌細(xì)胞)由北京生物物理所友情提供［2］。向RTCA Cardio E-Plate 96孔板每孔中加入50 μL滅菌后1 g· L－1明膠溶液，置于4℃過夜或37℃孵育4 h。棄去包被液，待RTCA Cardio E-Plate 96孔板干燥后，加入50 μL培養(yǎng)基，37℃孵育3-5 min后，將其放在RTCA Cardio工作站上測基線。

從液氮中取出hESC-CM冷凍管，立即將冷凍管的下半部浸入37℃水浴中，不斷搖晃1～2 min，待80 %細(xì)胞融化時(shí)從水浴中取出，酒精消毒后將冷凍管移至超凈臺中，立即將細(xì)胞逐滴加入10 mL預(yù)熱培養(yǎng)基中，邊加邊搖。待搖勻后，吸取100 μL細(xì)胞懸液于EP管中，加入100 μL臺盼藍(lán)染液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞于室溫條件下，300×g離心3 min。

細(xì)胞計(jì)數(shù)后將離心所得細(xì)胞制成4×108cells·L－1的細(xì)胞懸液，按照1∶1 000的比例向細(xì)胞懸液中加入Y10因子。RTCA E-Plate Cardio 96孔板每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，使孔中細(xì)胞數(shù)量達(dá)到每孔40 000個(gè)，室溫放置20～30 min后，將其放在RTCA Cardio工作站上監(jiān)測。每天換液，換液體積120 μL (總體積150 μL)。因?yàn)閔ESC-CM對溫度及培養(yǎng)環(huán)境的變化非常敏感，所以每次換液必須剩余部分培養(yǎng)液，以避免溫度及培養(yǎng)環(huán)境變化對細(xì)胞搏動信號的影響。第2次換液4 h后加藥。本實(shí)驗(yàn)采用0. 1% DMSO作為溶劑對照，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。采用奎尼丁作為陽性對照，奎尼丁的工作終濃度分別為0. 2、0. 78、3. 13、12. 5、50和100 μmol· L－1，每組4個(gè)復(fù)孔。分別觀察0. 1 % DMSO及奎尼丁對hESC-CM的CI值、搏動特征圖譜和標(biāo)準(zhǔn)化搏動頻率及幅度的影響。

1．4數(shù)據(jù)采集及處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由RTCA Cardio Software 1．0進(jìn)行控制和采集，數(shù)據(jù)采集設(shè)置每次測量時(shí)間為20 s，時(shí)間分辨率為12. 9 ms( Tab 1)。獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，使用RTCA Cardio Software 1．0對hESC-CM的搏動頻率和幅度進(jìn)行分析。各濃度組心肌細(xì)胞搏動頻率和搏動幅度均以給藥前的值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到標(biāo)準(zhǔn)化搏動頻率和標(biāo)準(zhǔn)化搏動幅度。

Tab 1 Data collection setting

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用RTCA Cardio software1．0軟件，SPSS 21. 0軟件及Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，用Levene's檢驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)的方差齊性，若方差齊，則進(jìn)行單因素方差分析( ANOVA) ;若方差不齊，則Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1心臟毒性評價(jià)方法的建立將hESC-CM接種到RTCA Cardio E-Plate 96孔板后上，放在培養(yǎng)箱中的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析工作站上培養(yǎng)96 h。隨著hESC-CM的貼壁生長，CI值逐漸增大直到細(xì)胞貼壁完全( Fig 1)。隨著hESC-CM不斷收縮舒張，可觀察到細(xì)胞特征性搏動圖譜( Fig 2)。最早可在細(xì)胞培養(yǎng)40 h后采集到hESC-CM持續(xù)搏動數(shù)據(jù)，細(xì)胞搏動頻率為28±55( 1/min)，幅度為0. 0050±0. 0115，節(jié)律不規(guī)則指數(shù)為21%±47%，此時(shí)節(jié)律不規(guī)則指數(shù)過大，搏動節(jié)律嚴(yán)重不規(guī)則。48 h換液后細(xì)胞搏動趨于穩(wěn)定，細(xì)胞搏動頻率為58±4( 1/min)，幅度為0. 0627±0. 0066，節(jié)律不規(guī)則指數(shù)降為7%±3%。由于換液過程中溫度的變化和新鮮培養(yǎng)液的加入會造成細(xì)胞搏動參數(shù)的改變，可以在換液后穩(wěn)定2～4 h再進(jìn)行加藥。96 h后節(jié)律不規(guī)則指數(shù)過大( Fig 3)，不再適宜加藥檢測，因此檢測藥物對hESC-CM影響最好在48～96 h之間完成。

Fig 1 Growth curve of hESC-CM at 96 h (±s，n =4)

Fig 2 Transient pulse patterns of hESC-CM cultured after different time points

2．2心臟毒性評價(jià)方法的驗(yàn)證

2．2．10. 1%DMSO對hESC-CM搏動狀態(tài)影響hESC-CM搏動穩(wěn)定后給予0.1%DMSO，觀察其對hESC-CM的CI值、搏動特征圖譜和搏動頻率及幅度的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)液組與0.1%DMSO組細(xì)胞生長曲線趨勢基本保持一致，CI值無明顯變化( Fig 4)，給予0.1%DMSO不影響hESC-CM的貼壁和生長;給予0. 1%DMSO后可觀察到與培養(yǎng)液組相似的持續(xù)、穩(wěn)定的細(xì)胞特征性搏動圖譜( Fig 5)，給予0.1% DMSO對hESC-CM收縮舒張產(chǎn)生的特征性搏動圖譜無明顯影響;給予0. 1 %DMSO后細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化搏動頻率和幅度與培養(yǎng)液組相比差異無顯著性( Fig 6，Tab 2、3)。因此，可以確定0. 1 %DMSO對hESC-CM搏動狀態(tài)無明顯影響。

Fig 3 Beating index of hESC-CM (±s，n =4)

Fig 4 Effect of 0．1 %DMSO on growth curve of hESC-CM (±s，n =4)

Fig 5 Effect of 0．1 %DMSO on transient pulse patterns of hESC-CM

Fig 6 Effect of 0．1 %DMSO on beating rate and amplitude of hESC-CM (±s，n =4)

2．2．2奎尼丁對hESC-CM搏動狀態(tài)影響hESC-CM搏動穩(wěn)定后給予不同濃度奎尼丁( 0. 2、0. 78、3. 13、12. 5、50和100 μmol·L－1)，觀察其對hESC-CM的CI值、搏動特征圖譜和搏動頻率及幅度的影響。結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，給藥后奎尼丁濃度≥50 μmol·L－1時(shí)影響細(xì)胞生長曲線，CI值明顯減小，且100 μmol·L－1組CI值減小較50 μmol·L－1組明顯( Fig 7)。與溶劑對照組相比，給藥后奎尼丁濃度≥3. 13 μmol·L－1時(shí)影響細(xì)胞特征性搏動圖譜，且具有一定的濃度－時(shí)間依賴性( Fig 8)。3. 13 μmol·L－1組給藥后，細(xì)胞搏動信號明顯減弱; 12. 5、50和100 μmol·L－1組給藥后，細(xì)胞搏動信號消失，12. 5 μmol·L－1組細(xì)胞搏動信號于給藥6 h后恢復(fù)出現(xiàn)，但信號明顯弱于溶劑對照組; 50 μmol·L－1組細(xì)胞搏動信號于給藥24 h后恢復(fù)出現(xiàn)，但信號明顯弱于溶劑對照組; 100 μmol·L－1組給藥后細(xì)胞搏動信號不再恢復(fù)出現(xiàn)。奎尼丁濃度≥3. 13 μmol·L－1時(shí)明顯抑制細(xì)胞搏動頻率和幅度，且具有明顯的濃度依賴性，濃度越高對細(xì)胞搏動頻率和幅度抑制越明顯，細(xì)胞搏動信號恢復(fù)所需時(shí)間越長( Fig 9，Tab 2、3)。

Fig 7 Effect of quinidine on growth curve of hESC-CM (±s，n =4)

Fig 8 Effect of quinidine on transient pulse patterns of hESC-CM

Fig 9 Effect of quinidine on bating rate and amplitude of hESC-CM (±s，n =4)

3　討論

RTCA Cardio系統(tǒng)能夠在近似生理環(huán)境下實(shí)時(shí)、定量、無標(biāo)記、非侵入性動態(tài)地監(jiān)測心肌細(xì)胞搏動頻率和幅度，進(jìn)而通過分析這些指標(biāo)變化評價(jià)藥物引起心肌細(xì)胞生長和搏動狀態(tài)變化，預(yù)測其潛在心臟毒性［5］。目前，羅氏等制藥公司已開始采用RTCA Cardio系統(tǒng)進(jìn)行藥物和候選化合物心臟毒性研究，美國FDA也已購買了RTCA Cardio系統(tǒng)，該系統(tǒng)的應(yīng)用前景十分廣闊。本實(shí)驗(yàn)室也已采用RTCA Cardio系統(tǒng)研究藥物對原代大鼠心肌細(xì)胞作用［6］，但國內(nèi)鮮有采用hESC-CM作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究鮮有報(bào)道，我們建立了以hESC-CM為基礎(chǔ)，運(yùn)用RTCA Cardio系統(tǒng)采集記錄hESC-CM生長和搏動信號的體外藥物心臟毒性早期篩選方法，并采用0. 1 %DMSO作為溶劑對照及奎尼丁作為陽性對照進(jìn)行了驗(yàn)證。

本研究中有一些關(guān)鍵點(diǎn)需要特別注意，( 1)細(xì)胞密度:細(xì)胞密度過高或過低都會影響細(xì)胞搏動穩(wěn)定性及規(guī)律性，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了3個(gè)密度進(jìn)行接種，發(fā)現(xiàn)40 000/孔為最佳細(xì)胞接種密度; ( 2)換液:每次換液須殘留部分培養(yǎng)液，以免溫度及細(xì)胞周圍環(huán)境變化過大，造成細(xì)胞搏動信號減弱或消失; ( 3)細(xì)胞狀態(tài):實(shí)驗(yàn)過程中，動作應(yīng)盡量輕柔，以避免對細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞狀態(tài); ( 4) Y10因子: Y10因子可以提高h(yuǎn)ESC-CM存活率，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)在接種前以1: 1000的比例加入Y10因子; ( 5)無菌操作:實(shí)驗(yàn)過程中必須保證無菌操作，細(xì)胞染菌后其搏動信號將會減小甚至消失; ( 6)加藥時(shí)間: hESC-CM接種培養(yǎng)48～96 h之間為最佳加藥檢測時(shí)間范圍，在此范圍內(nèi)，細(xì)胞搏動穩(wěn)定，可準(zhǔn)確的預(yù)測藥物的心臟毒性; ( 7)設(shè)置對照:本研究設(shè)有空白對照、溶劑對照及陽性對照以保證本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。

Tab 2 Effect of 0．1 %DMSO and quinidine on beating rate of hESC-CM (±s，n =4)

Tab 2 Effect of 0．1 %DMSO and quinidine on beating rate of hESC-CM (±s，n =4)

*P＜0．05，＊＊P＜0．01 vs 0．1 %DMSO group．

Group Before administration _________________________/1·min－1Administration 0．5 h/1·min－1______ Administration 1 h /1·min－1_________ Administration 2 h /1·min－1________ Administration 6 h /1·min－1________ Administration 12 h /1·min－1________ Administration 18 h /1·min－1_________ Administration 24h /1·min －1____ medium　60±1　61±1　60±2　63±3　61±4　60±2　58±5　47±3 0．1 %DMSO　57±1　52±2　52±2　56±3　56±0　52±2　51±3　44±3 0．2 μmol·L－1quinidine　63±2　57±5　56±9　63±4　60±2　59±2　50±5　47±0 0．78 μmol·L－1quinidine　57±4　52±5　54±5　53±6　52±4　55±9　51±7　45±7 3．13 μmol·L－1quinidine　58±2　15±26＊＊　22±20*　29±26＊＊　40±6　40±6＊＊　39±5*　38±5 12．5 μmol·L－1quinidine　55±2　0　0　0　10±17＊＊　31±6*　39±6＊＊　30±2＊＊50 μmol·L－1quinidine　57±0　0　0　0　0　0　0　26±5＊＊100 μmol·L－1quinidine_______59±4　0　0　0　0　0　0　0_______

Tab 3 Effect of 0．1% DMSO and quinidine on amplitude of hESC-CM (±s，n =4)

Tab 3 Effect of 0．1% DMSO and quinidine on amplitude of hESC-CM (±s，n =4)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0. 1 %DMSO group．

Group　Before ________________________________________________________________________________________________________________________________ __________administration Administration 0．0025　0．0407±0．0023　0．0413±0．0013 0．1 %DMSO　0．0566±0．0010　0．0563±0．0010　0．0578±0．0020　0．0568±0．0012　0．0515±0．0029　0．0478±0．0026　0．0455±0．0020　0．0455±0．0020 0．2 μmol·L－1quinidine　0．0642±0．0044　0．0598±0．0039　0．0606±0．0033　0．0588±0．0040　0．0546±0．0041　0．0460±0．0028　0．0454±0．0013　0．0471±0．0023 0．78 μmol·L－1quinidine　0．0544±0．0021　0．0513±0．0027　0．0551±0．0006　0．0532±0．0007　0．0519±0．0007　0．0445±0．0014　0．0420±0．0036　0．0417±0．0064 3．13 μmol·L－1quinidine　0．0572±0．0061　0．0156±0．0271＊＊0．0377±0．0331　0．0352±0．00305　0．0501±0．0021　0．0418±0．0055　0．0409±0．0083　0．0388±0．0095 12．5 μmol·L－1quinidine　0．0543±0．0039　0　0　0　0．0138±0．0240＊＊　0．0373±0．0047*　0．0343±0．0094　0．0350±0．0091 50 μmol·L－1quinidine　0．0509±0．0097　0　0　0　0　0　0　0．0390±0．0300＊＊100 μmol·L－1quinidine_____ 24_h Medium　0．0578±0．0039　0．0555±0．0047　0．0540±0．0032　0．0538±0．0045　0．0506±0．0038　0．0431± Administration 0．5_h___________ Administration 1_h____________ Administration 2_h____________ Administration 6_h____________ Administration 12_h___________ Administration 18_h____________________ 0．0565±0．0003　0　0　0　0　0　0　0______

DMSO是一種“萬能溶劑”，很多藥物都可采用DMSO溶解。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DMSO濃度≤0. 1 %時(shí)不會造成細(xì)胞損傷［7］。我們檢測了hESC-CM給予0. 1 % DMSO后24 h內(nèi)細(xì)胞搏動頻率及幅度的變化，并與hESC-CM給予培養(yǎng)液后24 h內(nèi)細(xì)胞搏動頻率及幅度的變化進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，0. 1 %DMSO對hESC-CM的CI值，細(xì)胞特征性搏動圖譜以及搏動頻率和幅度變化均無影響，證明了0. 1 % DMSO對hESCCM生長及搏動狀態(tài)沒有明顯影響，為后續(xù)研究將其作為溶劑對照提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究采用奎尼丁作為陽性藥物進(jìn)行驗(yàn)證?？岫∈桥R床上應(yīng)用最早且效果明顯的抗心律失常藥物，其對單純性室性心律失?；颊叩挠行士蛇_(dá)到81. 2 %，對房性心律失?；颊叩挠行士蛇_(dá)到65. 8 %［8］。但是，奎尼丁是一種非選擇性鈉離子通道阻滯劑，治療過程中容易造成心臟離子電流失衡，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致患者死亡［9］。研究表明奎尼丁可通過增大心臟跨室壁復(fù)極離散，導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速［10］。本研究通過RTCA Cardio系統(tǒng)監(jiān)測了不同濃度奎尼丁( 0. 2、0. 78、3. 13、12. 5、50和100 μmol·L－1)對hESC-CM生長及搏動狀態(tài)的影響。與溶劑對照組相比，奎尼丁濃度為0. 2和0. 78 μmol·L－1時(shí)對hESCCM生長及搏動無明顯影響?？岫舛取?. 13 μmol·L－1時(shí)影響細(xì)胞和特征性搏動圖譜，抑制細(xì)胞搏動頻率和幅度，且具有劑量依賴性，濃度越高細(xì)胞搏動信號恢復(fù)所需時(shí)間越長，對搏動頻率和幅度的抑制作用越明顯。這與采用微電極陣列技術(shù)檢測不同濃度奎尼丁對hESC-CM場電位時(shí)程作用結(jié)果相同［11］。這些結(jié)果表明提示該方法可以用于臨床前藥物體外心臟毒性早期篩選。

綜上所述，我們成功建立了基于人胚胎干細(xì)胞和實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)的臨床前藥物體外心臟毒性早期篩選方法，并采用0. 1 % DMSO和奎尼丁進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)所用hESC-CM為人源性細(xì)胞，避免了種屬差異，臨床預(yù)測準(zhǔn)確性較高，能夠?yàn)榕R床試驗(yàn)提供大量可靠的新藥心臟毒性作用的相關(guān)信息。該方法能夠?qū)ESC-CM進(jìn)行長時(shí)間實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測，準(zhǔn)確預(yù)測非離子通道藥物潛在的心臟毒性，具有低成本、高通量、實(shí)驗(yàn)周期短、所需化合物少的優(yōu)點(diǎn)，非常適用于藥物心臟毒性早期篩選。

(本研究于國家上海新藥安全評價(jià)研究中心完成，衷心感謝我的導(dǎo)師馬璟主任在本實(shí)驗(yàn)研究過程中的指導(dǎo)，并為我的研究生學(xué)習(xí)和課題研究提供領(lǐng)先的實(shí)驗(yàn)設(shè)施和充足的資金支持!衷心感謝一般毒理組全體老師和員工的鼎力支持和無私幫助!特別感謝汪溪潔老師在整個(gè)課題的設(shè)計(jì)、試驗(yàn)開展、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和論文撰寫等過程中給予的莫大幫助、支持和鼓勵!衷心感謝王淑顏、惠濤濤等所有曾經(jīng)幫助、支持和鼓勵過我的員工!衷心感謝北京生物物理所提供的hESC-CM! )

參考文獻(xiàn):

［1］Laverty H G，Benson C，Cartwright E J，et al．How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines［J］．Br J Pharmacol，2011，163( 4) : 675－93．

［2］Kehat I，Kenyagin-Karsenti D，Snir M，et al．Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes［J］．J Clin Invest，2001，108 ( 3) : 407－14．

［3］Jonsson M K，Duker G，Tropp C，et al．Quantified proarrhythmic potential of selected human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes［J］．Stem Cell Res，2010，4( 3) : 189－200．

［4］Peng S，Lacerda A E，Kirsch G E，et al．The action potential and comparative pharmacology of stem cell-derived human cardiomyocytes［J］．J Pharmacol Toxicol Methods，2010，61( 3) : 277－86．

［5］Wang T，Hu N，Cao J，et al．A cardiomyocyte-based biosensor for antiarrhythmic drug evaluation by simultaneously monitoring cell growth and beating［J］．Biosens Bioelectron，2013，49C: 9－13．

［6］王淑顏，汪溪潔，靳康，等．運(yùn)用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測原代乳鼠心肌細(xì)胞的生長及搏動評價(jià)抗心律失常藥物［J］．中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28( 6) : 837－43．

［6］Wang S Y，Wang X J，Jin K，et al．A real-time cell analysis system for evaluating anti-arrhythmic drugs by monitoring the growth and beating of primary neonatal rat cardiomyocytes［J］．Chin J Pharmacol Toxicol，2014，28( 6) : 837－43．

［7］Pal R，Mamidi M K，Das A K，et al．Diverse effects of dimethyl sulfoxide ( DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells［J］．Arch Toxicol，2011，86( 4) : 651－61．

［8］李應(yīng)祥．抗心律失常藥物作用于心率失常的效果評價(jià)［J］．中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2014，2( 8) : 32－3．

［8］Li Y X．Evaluation of the effect of antiarrhythmic drugs on arrhythmia［J］．Cardiov Dis J Integ Tradit Chin Western Med，2014，2 ( 8) : 32－3．

［9］王小川，謝曉慧，陸浩，等．抗心律失常藥物致心律失常作用的文獻(xiàn)分析［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33( 21) : 1825－6．

［9］Wang X C，Xie X H，Lu H，et al．The literature analysis of the arrhythmogenic effect of antiarrhythmic drugs［J］．Chin Hosp Pharm J，2013，33( 21) : 1825－6．

［10］周強(qiáng)，李泱，劉啟功，等．奎尼丁相關(guān)性尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19 ( 4) : 415－8．

［10］Zhou Q，Li Y，Liu Q G，et al．Experimental study on the mechanism of quinidine induced torsade de pointes in rabbit heart［J］．Chin Pharmacol Bull，2003，19( 4) : 415－8．

［11］Braama S R，Tertoolena L，van de Stolpe A，et al．Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes［J］．Stem Cell Res，2010，4( 2) : 107－16．

◇研究簡報(bào)◇

Establishment of the method to evaluate cardiac toxicity by real-time cell analysis system on human embryonic stem cells

ZHAO Qi，WANG Xi-jie，WANG Shu-yan，MA Jing
( Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation Research State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 201203，China)

Abstract:AimTo establish an in vitro early drug cardiac toxicity evaluation method by human embryonic stem cells derived cardiomyocytes ( hESC-CM) and real-time cell analysis Cardio ( RTCA Cardio) system．Method The hESC-CM were cultured at RTCA Cardio E-Plate 96．Impedance signals from hESC-CM were analyzed for beating rate，contraction amplitude and beating rhythm irregularity to determine the optimum inoculation density and detection duration．Based on this，we used 0．1 %DMSO to be the solvent and quinidine ( 0．2，0．78，3．13，12．5，50 and 100 μmol·L－1) known as affecting cardiac activity to validate this method．Result The results revealed no significant changes in the cell index ( CI)，transient pulse patterns，beating rate and amplitude of hESC-CM．Quinidine will affect the CI and transient pulse patterns of hESC-CM and decrease the beating rate and amplitude of hESC-CM when its concentration≥3. 13 μmol· L－1．And this effect is concentration-dependent，the higher the concentration，the more time they need to recover beating and the more significant the beating rate and amplitude inhibition of quinidine on hESC-CM．ConclusionThe method established by hESC-CM and RTCA Cardio system can detect the effect of quinidine on the contraction of hESC-CM，and this indicates that this method has the potential to be an attractive high-throughput tool for screening potential drugs in early evaluation of drug cardiotoxicity．

Key words:hESC-CM; RTCA Cardio; cardiotoxicity; drug; in vitro screening; quinidine

作者簡介:趙琪( 1990－)，女，碩士生，研究方向:藥物毒理學(xué)，E-mail: zhqi1990@126．com;

基金項(xiàng)目:“十二五”國家科技部重大新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目( No 2012ZX09302002)

收稿日期:2015－10－02，修回日期: 2015－11－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2015) 01－0138－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．029