張　元，王　火，牛　聰，曹　波，陳　虹

( 1．武警新疆總隊(duì)南疆指揮部醫(yī)院，新疆喀什　844000;2．武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津　300162; 3．武警總醫(yī)院，北京　100039;4．武警后勤學(xué)院，天津　300309)

?

多靶點(diǎn)鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機(jī)制研究

張?jiān)?，王火2，牛聰3，曹波4，陳虹4

( 1．武警新疆總隊(duì)南疆指揮部醫(yī)院，新疆喀什844000;2．武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津300162; 3．武警總醫(yī)院，北京100039;4．武警后勤學(xué)院，天津300309)

中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R329. 24; R329. 25; R341; R730. 53; R979. 19

關(guān)鍵詞:鬼臼毒素衍生物;多靶點(diǎn); P糖蛋白;抗腫瘤;抗多藥耐藥;微管蛋白

曹波( 1981－)，男，博士，講師，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: caobo19841@126．com

Anti-MDR tumor activities of CCP-1: a new multi-target podophyllotoxin derivative and its molecular mechanism

ZHANG Yuan1，WANG Huo2，NIU Cong3，CAO Bo4，CHEN Hong4
( 1．Xinjiang Provincial Corps South-region Command Post Hospital of CAPF，Kashgar Xinjiang844000，China; 2．Affiliated Hospital of Logistics University of CAPF，Tianjin 300162，China; 3．General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China; 4．Logistics University of CAPF，Tianjin 300309，China)

Key words:podophyllotoxin derivatives; multi-target; P-gp; anti-tumor; anti-MDR;tubulin

以往單一靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物極易產(chǎn)生耐藥［1－3］。多靶點(diǎn)的化療藥物具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如多靶點(diǎn)的化療藥物是單分子化合物，不存在多藥物聯(lián)合應(yīng)用中的藥物相互作用問(wèn)題，也可避免藥物聯(lián)合應(yīng)用中藥物配伍、劑量、給藥方式等問(wèn)題。本課題組以天然產(chǎn)物中鬼臼毒素為母核，整合了具有抗腫瘤耐藥的小分子片段，將鬼臼毒素新衍生物設(shè)計(jì)為同時(shí)作用于多個(gè)耐藥靶點(diǎn)的化合物，以更好的克服傳統(tǒng)單靶點(diǎn)化療藥物易產(chǎn)生多藥耐藥的缺陷。前期篩選發(fā)現(xiàn)衍生物CCP-1具有良好的抗腫瘤多藥耐藥的作用。本文將對(duì)CCP-1的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用及其可能作用機(jī)制作初步探討。

1　材料與方法

1．1一般材料CCP-1，分子質(zhì)量614. 6。依托泊苷( etoposide，VP-16)，分子質(zhì)量588. 56。人口腔鱗癌細(xì)胞KB及其長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞株KBv200，人慢性髓性白血病急變期細(xì)胞K562及其阿霉素耐藥株K562/A02培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中。♂昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)。動(dòng)物移植性腫瘤S180肉瘤由天津藥物研究院傳代保種。

1．2方法

1．2．1 MTT法測(cè)定CCP-1對(duì)多藥耐藥細(xì)胞的抗腫瘤活性按照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行測(cè)定。

1．2．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞凋亡率的影響加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．2．3 CCP-1對(duì)耐藥相關(guān)基因mdr-1表達(dá)的影響加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)處理細(xì)胞。PCR分析:βactin作為內(nèi)標(biāo)，靶基因?yàn)閙dr-1。

1．2．4免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的影響［5］加入CCP-1( 1. 0、2. 0、4. 0 μmol·L－1)，滴加兔抗人多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)、鼠抗兔IgG二抗。光鏡觀察并照相。

1．2．5免疫熒光法檢測(cè)CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞微管蛋白的影響給藥組加入等濃度的CCP-1、長(zhǎng)春新堿和紫杉醇，滴加兔抗人多克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗兔IgG二抗、DAPI染液，高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。

1．2．6動(dòng)物移植腫瘤模型研究CCP-1體內(nèi)抗腫瘤作用按照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行測(cè)定。

1．2．7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件包處理分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析( One-way ANOA)，顯著性水準(zhǔn)為0. 05。

2　結(jié)果

2．1MTT法測(cè)定CCP-1對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響從Tab 1、2可以看出CCP-1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用( IC50: 1. 41～3. 34 μmol·L－1)，與VP-16相比CCP-1顯示了更強(qiáng)的抗腫瘤活性，且對(duì)多藥耐藥細(xì)胞株的殺傷作用明顯高于臨床上廣泛使用的VP-16。

2．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞凋亡率的影響

CCP-1( 1. 0～4. 0 μmol·L－1)可誘導(dǎo)KBv200細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，且有明顯量效關(guān)系。

2．3CCP-1對(duì)mdr-1基因mRNA表達(dá)的影響本研究發(fā)現(xiàn)CCP-1隨給藥濃度的增加可使mdr-1的mRNA表達(dá)量減少，有較明顯的劑量依賴性。

2．4免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨劑量的增加，CCP-1有降低P-gp蛋白表達(dá)的明顯趨勢(shì)。

2．5免疫熒光法檢測(cè)CCP-1對(duì)KBv200細(xì)胞微管蛋白的影響實(shí)驗(yàn)顯示長(zhǎng)春新堿能夠阻止微管結(jié)構(gòu)的合成，而CCP-1作用于KBv200細(xì)胞6 h后，與紫杉醇作用結(jié)果相似，能夠促進(jìn)微管聚合、抑制微管解聚。

2．6CCP-1對(duì)小鼠實(shí)體型S180肉瘤的抑制作用腹腔注射CCP-1( 25、50 mg·kg－1·d－1)，對(duì)小鼠實(shí)體型S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制率分別為55. 11%和62. 72%。在小鼠體重方面，高低劑量組與陰性對(duì)照組相比較未見(jiàn)明顯減輕( P＞0. 05)。陽(yáng)性對(duì)照組依托泊苷( 20 mg·kg－1·d－1)抑瘤率為58. 54%，但小鼠體重與陰性對(duì)照組相比有明顯降低(體重下降20%)，且出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象(死亡4只)。

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

Tab 1 Multiple drug resistance of KBv200(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

IC50/μmol·L－1KB　KBv200　Mult of Drug fast Vincristine　0．28±0．07　9．25±1．03　33．04 Etoposide　1．71±0．04　12．1±1．23　7．07＊＊CCP-1　1．41±0．06　2．06±0．38＊＊　1．46＊＊

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

Tab 2 Multiple drug resistance of K562/A02(±s，n =3)

＊＊P＜0．01 vs control

ADM　0．34±0．11　12．22±1．25　35．94 Etoposide　3．56±0．23　34．76±4．23　9．76＊＊CCP-1　1．02±0．58　3．34±1．12＊＊　3．27＊＊IC50/μmol·L－1K562　K562/A02　Mult of Drug fast

Tab 3 Inhibitory effect of CCP-1 on transplantable sarcoma S180 in mice( n =10 per group)

Fig 1 Chemical structure of CCP-1

3　討論

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系的研究，引入活性基團(tuán)，合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的鬼臼毒素衍生物，其中CCP-1是將小分子5-甲氧基吲哚引入天然產(chǎn)物鬼臼毒素中合成的全新化合物，4β-( 5-甲氧基吲哚3-草酰氨基) -4-脫氧表鬼臼毒素( Fig 1)，具有微管蛋白的抑制劑活性。

本實(shí)驗(yàn)中，MTT法結(jié)果顯示CCP-1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞敏感，與抗癌藥物依托泊苷相比，其抗腫瘤活性更強(qiáng)，顯示了其高效低毒，抗癌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)耐藥細(xì)胞也有明顯的抑制活性。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)CCP-1可使細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，由此推斷CCP-1可能通過(guò)凋亡途徑來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。經(jīng)典的MDR主要與一種相對(duì)分子質(zhì)量為170 ku的跨膜糖蛋白( P-gp)有關(guān)［7－8］。分子水平研究顯示: CCP-1可使KBv200細(xì)胞中mdr-1基因mRNA水平下降，免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示了相同的作用，不同濃度的CCP-1均可使KBv200細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)量降低。由此提示CCP-1誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)降低p-gp高表達(dá)細(xì)胞株上p-gp的表達(dá)，從而增加多藥耐藥細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性。含有微管蛋白的結(jié)構(gòu)，如微管等，對(duì)有絲分裂過(guò)程中紡錘體的形成非常重要，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂以及細(xì)胞骨架組成中扮演關(guān)鍵角色。免疫熒光法檢測(cè)顯示CCP-1能夠促進(jìn)微管聚合、抑制微管解聚，這可能是其引起細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要原因。動(dòng)物移植腫瘤模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCP-1對(duì)小鼠實(shí)體肉瘤S180的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于VP-16且毒性更小。

綜上所述，CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機(jī)制可以歸結(jié)為下調(diào)mdr-1基因的表達(dá)，從而減少P-gp蛋白表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥表型，同時(shí)作用于微管蛋白促進(jìn)微管聚合，進(jìn)而誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡。CCP-1較本實(shí)驗(yàn)室先前合成的鬼臼毒素衍生物YB-L1EPO、YB-1EPN等有更強(qiáng)的抗腫瘤活性及抗多藥耐藥性，且毒性更小，有望成為新型高效的多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物。

參考文獻(xiàn):

［1］袁斐，白鋼鋼，苗筠杰．中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的研究進(jìn)展［J］．中草藥，2014，45( 6) : 857－63．

［1］Yuan F，Bai G G，Miao Y J，et al．Research progress in Chinese materia medica reversing multidrug resistance on tumor cells［J］．Chin Tradit Herbal Drugs，2014，45 ( 6) : 857－63．

［2］姬汴生，何玲．氨氯地平衍生物CJX1對(duì)人耐藥腫瘤細(xì)胞P-gp ATP酶活性的影響［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24( 12) : 1603－6．

［2］Ji B S，He L．Effects of CJX1，an amlodipine derivative，on ATPase activity of human P-glycoprotein in resistant tumor cells［J］．Chin Pharmacol Bull，2008，24( 12) : 1603－6．

［3］Mi Y J，Liang Y J，Huang H B，et al．Apatinib ( YN968D1) reverses multidrug resistance by Inhibiting the efflux function of multiple ATP-Binding Cassette transporters［J］．Cancer Res，2010，70 ( 20) : 7981－91．

［4］馮欲靜，牛聰，曹波．鬼臼毒素衍生物NY-3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及其機(jī)制探究［J］．武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，23( 1) : 9－12．

［4］Feng Y J，Niu C，Cao B．Exploration on the induction of apoptosis on HeLa cells by podophyllotoxin derivate NY-3 and its mechanism ［J］．J Logistics Univ PAPF( Med Sci)，2014，23( 1) : 9－12．

［5］溫進(jìn)坤，韓梅．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論與研究技術(shù)［M］．2版．北京:科學(xué)出版社，2002．218－392．

［5］Wen J K，Han M．Theory and Technique of Medical Molecular Biology［M］．Beijing: China Science Publishing＆Media LTD．2002，218－392．

［6］張志強(qiáng)，魏寅祥，趙青．瓦他拉尼對(duì)乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)研究［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30 ( 6) : 774－82．

［6］Zhang Z Q，Wei Y X，Zhao Q，et al．Reversal effect of vatalanib on BCRP－mediated multidrug resistance［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 6) : 774－82．

［7］Shi R，Peng H，Yuan X，et al．Down-regulation of c-fos by shRNA sensitizes adriamycin-resistant MCF-7/ADR cells to chemotherapeutic agents via P-glycoprotein inhibition and apoptosis augmentation［J］．J Cell Biochem，2013，114( 8) : 1890－900．

［8］Binkhathlan Z，Lavasanifar A．P-glycoprotein inhibition as a therapeutic approach for overcoming multidrug resistance in cancer: current status and future perspectives［J］．Curr Cancer Drug Targets，2013，13( 3) : 326－46．

作者簡(jiǎn)介:張?jiān)? 1982－)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: 306064053@ qq．com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 30873363) ;武警后勤學(xué)院博士啟動(dòng)金( No WHTD201304-2)

收稿日期:2015－09－07，修回日期: 2015－11－13

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0144－02 1001－1978( 2016) 01－0144－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030 10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．030