孫世光

( 1．山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南　250001;2.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南　250001; 3．山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南　250355)

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高架〇迷宮實(shí)驗(yàn):昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的重測(cè)信度研究

孫世光1，2，3

( 1．山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南250001;2.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南250001; 3．山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355)

中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R363-332; R749．72

摘要:目的探討高架〇迷宮實(shí)驗(yàn)( elevated zero maze，EZM)作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的重測(cè)信度。方法昆明小鼠( 4周齡，♂/♀)進(jìn)行EZM實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔1周進(jìn)行2次，采用攝像系統(tǒng)記錄5 min行為變化，包括兩臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間及進(jìn)入次數(shù);納入實(shí)驗(yàn)參數(shù)有:開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率( Otime%)、開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間( Otime)、閉臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間( Ctime)、開臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)百分率( Oentries%)、開臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)( Oentries)、閉臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)( Centries)及兩臂區(qū)進(jìn)入總次數(shù)( Entries) ;通過組內(nèi)相關(guān)系數(shù)( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數(shù)( kappa agreement index，κ) 對(duì)EZM進(jìn)行重測(cè)信度檢驗(yàn)，并分析性別、重復(fù)測(cè)量等因素對(duì)EZM行為模式的影響。結(jié)果ICC結(jié)果顯示，Otime% (♂ICC =0．753，P＜0．01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC = 0. 719，P＜0. 01;♀ICC = 0. 494，P ＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測(cè)重測(cè)信度相對(duì)較好，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;κ結(jié)果顯示，Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries(♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ=0. 469，P＜0. 01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但初測(cè)重測(cè)信度相對(duì)較差。結(jié)論Otime%、Entries作為EZM評(píng)價(jià)狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的穩(wěn)定參數(shù)，具有尚可接受的重測(cè)信度;尤其應(yīng)注意♂/♀(強(qiáng)烈推薦♂)對(duì)EZM重測(cè)信度影響效應(yīng)相對(duì)較大，而重復(fù)測(cè)量影響效應(yīng)相對(duì)較小。

關(guān)鍵詞:高架〇迷宮;狀態(tài)焦慮;動(dòng)物模型;重測(cè)信度;性別;重復(fù)測(cè)量;昆明小鼠

高架〇迷宮實(shí)驗(yàn)( elevated zero maze，EZM)是評(píng)價(jià)狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的經(jīng)典方法之一，廣泛應(yīng)用于精神神經(jīng)藥理學(xué)基礎(chǔ)研究; EZM源于高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)( elevated plus maze，EPM)，兩者原理都是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索習(xí)性與危險(xiǎn)環(huán)境之間的矛盾沖突。EZM作為焦慮動(dòng)物模型進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，常受實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、性別等諸多因素影響而導(dǎo)致結(jié)果不盡一致［1－3］;本研究采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數(shù)( kappa agreement index，κ)［4］，初步探討EZM作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的重測(cè)信度，篩選出穩(wěn)定參數(shù)，并進(jìn)行行為模式分析。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，♂/♀，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK(魯) 20130001;室溫( 20±2)℃，光照12 h( 18: 00～6: 00)和黑暗12 h( 6: 00～18: 00)環(huán)境，自由進(jìn)水飲食飼養(yǎng);預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量( 20±2) g小鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)(所有實(shí)驗(yàn)均于6: 00～18: 00進(jìn)行)。

1．2實(shí)驗(yàn)裝置木質(zhì)〇迷宮( 65 cm×5 cm)，包括2部分:兩相對(duì)開臂區(qū)( 30 cm×5 cm)，兩相對(duì)閉臂區(qū)，附有立墻( 30 cm×5 cm×30 cm) ;〇迷宮離地面50 cm，實(shí)驗(yàn)由25 W紅燈泡離圓心40 cm高處照明［5］。

1．3實(shí)驗(yàn)操作操作者將小鼠放入高架〇迷宮任一開臂區(qū)中間，頭面對(duì)圓心，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5 min的行為變化，包括兩臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間及進(jìn)入次數(shù);其中，小鼠4只爪子由一臂區(qū)均進(jìn)入另一臂區(qū)方可開始記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清除糞便，用70%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布抹干，以免前一只動(dòng)物的殘留氣味造成對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的影響;全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后由不熟悉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人員進(jìn)行數(shù)據(jù)提取錄入。EZM納入實(shí)驗(yàn)參數(shù)有:開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率( Otime%)、開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間( Otime)、閉臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間( Ctime)、開臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)百分率( Oentries%)、開臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)( Oentries)、閉臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)( Centries)及兩臂區(qū)進(jìn)入總次數(shù)( Entries) ;其中實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries數(shù)據(jù)又進(jìn)行分割細(xì)化處理，按照5個(gè)重復(fù)測(cè)量片段( 1 min)來進(jìn)行提取。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13．0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 6．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。重測(cè)信度采用ICC和κ統(tǒng)計(jì)參數(shù)來評(píng)價(jià)，其中ICC參數(shù)主要適用于連續(xù)變量或等級(jí)變量，由Analyze→Scale→Reliability Analysis程序完成;κ參數(shù)主要適用于分類變量，由Analyze→Descriptive statistics→Crosstabs程序完成，分析前首先根據(jù)1st分位數(shù)、3rd分位數(shù)進(jìn)行低( Low≤1st分位數(shù))、中( 1st分位數(shù)＜Medium＜3rd分位數(shù))、高( High≥3rd分位數(shù))狀態(tài)分類; ICC/κ: ＞0. 75認(rèn)為一致性很好，0. 50～0. 75認(rèn)為一致性一般，＜0．50則認(rèn)為一致性較差。此外，EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)，而后依據(jù)其結(jié)果，總體數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，而重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)則進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)和Friedman檢驗(yàn)［4，6－9］。

Tab 1 Intraclass correlation coefficient ( ICC) between Test and Retest of elevated zero maze

Tab 2 Kappa agreement index (κ) between Test and Retest of elevated zero maze

2　結(jié)果

Fig 1 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Otime%”parameter

Fig 2 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter

2．1EZM重測(cè)信度檢驗(yàn)ICC參數(shù)提示，Otime% (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC =0. 719，P＜0. 01;♀ICC =0. 494，P＜0. 05; ♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC =0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC =0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測(cè)重測(cè)信度較好，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Tab 1，F(xiàn)ig 1、2。κ參數(shù)提示，Otime% (♂κ=0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ= 0. 469，P＜0. 01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但初測(cè)重測(cè)信度相對(duì)較差。見Tab 2、3、4。

2．2EZM行為模式分析Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)提示，Otime%、Entries總體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，而重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)則僅部分符合正態(tài)分布( P＞0. 05)。t檢驗(yàn)結(jié)果提示，與初測(cè)相比，重測(cè)EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime% (♂t(yī) = 0. 447，♀t = 1. 626，♂+♀t = 1. 612，P＞0. 05)、Entries(♂t(yī) =－0. 441，♀t =0. 949，♂+♀t =0. 551，P＞0. 05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wilcoxon檢驗(yàn)結(jié)果提示( Fig 3)，與初測(cè)相比，重測(cè)EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%在第2ndmin(♀z =－3. 37，P＜0. 01;♂+♀z=－2. 70，P＜0. 01)均降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Entries亦在第2ndmin(♀z =－2. 74，P＜0. 01)降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Friedman檢驗(yàn)結(jié)果提示，初測(cè)EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%(♂χ2=16. 63，P＜0. 01;♀χ2=11. 22，P＜0. 05;♂+♀χ2=26. 88，P＜0. 01)、Entries(♀χ2=22. 29，P＜0. 01; ♂+♀χ2=21. 77，P＜0. 05)及重測(cè)EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime% (♂χ2=13. 58，P＜0. 01;♀χ2=31. 38，P＜0. 01;♂+♀χ2=41. 91，P＜0. 01)、Entries(♂χ2= 13. 52，P＜0. 01;♂+♀χ2=16. 53，P＜0. 01)重復(fù)測(cè)量片段間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 3 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the “Otime%”parameter categories ( low，medium and high)

Tab 4 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter categories ( low，medium and high)

3　討論

EZM是Shepherd等［10］于1992年最先提出，其原理亦是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索習(xí)性與危險(xiǎn)環(huán)境之間矛盾沖突，是一種相當(dāng)于EPM變型的新型焦慮動(dòng)物模型;但是EZM又不同于EPM［10－11］:①?zèng)]有中央?yún)^(qū)，不存在中央“死時(shí)間”;②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索行為是連續(xù)的，不受到兩臂區(qū)末端影響;③兩臂區(qū)之間可以直接轉(zhuǎn)換，不需要經(jīng)過中央?yún)^(qū)過渡，而EZM同時(shí)也存在這樣一個(gè)問題:即兩臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)通常相等或者僅差1，導(dǎo)致兩臂區(qū)進(jìn)入次數(shù)百分率實(shí)驗(yàn)參數(shù)失去評(píng)價(jià)意義。

Shepherd等［12］研究發(fā)現(xiàn)，抗焦慮藥物可明顯增加SD大鼠EZM開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率和開臂區(qū)低頭探索頻次，減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次，而致焦慮藥物則產(chǎn)生相反效應(yīng);同時(shí)一定劑量范圍抗抑郁藥物5-HT1A受體激動(dòng)劑( 0. 001～0. 1 mg·kg－18-OH-DPAT)可減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次，5-HT3A受體拮抗劑( 0. 0001～1. 0 mg·kg－1昂丹司瓊)可增加開臂區(qū)進(jìn)入時(shí)間百分率，減少由閉臂區(qū)向開臂區(qū)伸軀探索頻次。Cook等［13］研究比較了3個(gè)不同遠(yuǎn)交品系和2個(gè)不同雜交品系小鼠對(duì)EZM重復(fù)測(cè)量效應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)不同品系是通過不同感官(視覺、嗅覺等)來收集EZM初始位置，以避免進(jìn)入EZM開臂區(qū)危險(xiǎn)域。Milner等［14］研究比較了15個(gè)不同近交品系小鼠焦慮動(dòng)物模型行為模式，發(fā)現(xiàn)EZM及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、明暗箱實(shí)驗(yàn)中反映焦慮情緒相關(guān)行為參數(shù)與反映運(yùn)動(dòng)探索相關(guān)行為參數(shù)無法區(qū)分，而與反映緊張情緒糞便粒數(shù)參數(shù)可以加以區(qū)分。Kulkarni等［15］研究不同類別抗焦慮藥物，包括安定類、巴比妥類、乙醇、印防己毒素(通道阻滯劑)、戊四唑、氟馬西尼( BDZRs拮抗劑)等，發(fā)現(xiàn)EZM對(duì)以苯二氮卓類受體( BDZRs) -γ-氨基丁酸A受體( GABAAR) -氯離子通道復(fù)合物為作用靶點(diǎn)的工具藥物均有效。

Fig 3 Behavioral pattern of elevated zero maze for the“Otime%”( ABC)＆“Entries”( DEF) parameters during a 5-minute observation period

本研究ICC和κ結(jié)果均提示，EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)重測(cè)信度受性別影響較大，♂昆明小鼠EZM重測(cè)信度相對(duì)較好(尤其是Otime%和Entries)，而♀昆明小鼠EZM重測(cè)信度相對(duì)較差; Wilcoxon檢驗(yàn)結(jié)果也顯示僅♀昆明小鼠EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries在初測(cè)重測(cè)第2ndmin均有顯著性差異。此外，盡管Friedman檢驗(yàn)結(jié)果顯示♂/♀昆明小鼠EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries在5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)片段中具有波動(dòng)性，但是t檢驗(yàn)結(jié)果仍然證實(shí)，♂/♀昆明小鼠EZM實(shí)驗(yàn)參數(shù)Otime%、Entries受重復(fù)測(cè)量效應(yīng)影響相對(duì)較小。因此，EZM作為昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，推薦采用Otime%、Entries實(shí)驗(yàn)參數(shù)，推薦采用♂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而間隔1周重復(fù)測(cè)量效應(yīng)可以忽略。動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物效應(yīng)的有力工具;動(dòng)物模型行為具有多維性，是結(jié)構(gòu)和功能共同相互作用的結(jié)果;有關(guān)EZM狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型相關(guān)研究將在后續(xù)研究陸續(xù)報(bào)道。

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Elevated zero maze as an animal model of state anxiety in Kunming mice: test-retest reliability

SUN Shi-guang1，2，3
( 1．Dept of Pharmacy，Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine Jinan 250001，China; 2. Dept of Pharmacy，Shandong Provincial Hospital of Integrated Medicine，Jinan 250001，China; 3．College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Abstract:AimTo explore the test-retest reliability of elevated zero maze ( EZM)，as an animal model of state anxiety in Kunming mice．Methods The behavior of adult，male and female，Kunming mice in EZM was recorded twice，for five minutes，with a one-week inter-trial interval．The following parameters were evaluated: percentage of time on EZMopen arms ( Otime%)，time on EZM open arms ( Otime)，time on EZM closed arms ( Ctime)，percentage of entries into EZM open arms ( Oentries%)，entries into EZM open arms ( Oentries)，entries into EZM closed arms ( Centries)，total entries into EZM open and closed arms ( Entries)．Subsequently，the intraclass correlation coefficient ( ICC) and the kappa agreement index (κ) were calculated for these parameters．Results ICC for Otime%(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，Otime (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)，Ctime (♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，and Oentries (♂ICC =0. 719，P＜0. 01; ♀ICC =0. 494，P＜0. 05;♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)， Centries (♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)，Entries (♂ICC = 0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 05) showed a good and fair test-retest reliability，respectively．Only κ for Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)，Ctime (♂κ=0. 393，P＜0. 05)，Oentries (♂κ= 0. 308，P ＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)，Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ=0. 238，P＜0. 05)，Entries (♂κ=0. 469，P＜0. 01) displayed a significant but poor reliability between the test-retest trials．ConclusionsThe parameters Otime% and Entries for Kunming mice in EZM are stable over time，and indicate an acceptable reliability with a one-week inter-trial interval．Meanwhile，more attention should be paid not to repeated measure effect，but to the sex effect ( Male animals recommended to EZM，especially)．

Key words:elevated zero maze; state anxiety; animal model; test-retest reliability; sex; repeated measurement; Kunming mice

作者簡(jiǎn)介:孫世光( 1983－)，男，博士生，主管中藥師，通訊作者，研究方向:方劑配伍規(guī)律與證候動(dòng)物模型構(gòu)建及其評(píng)價(jià)，Tel: 0531-82436123/82436487，E-mail: s．g．sun@ hotmail．com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目( No 81302887) ;山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( No 2014GSF119034) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( No 2015-131) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( No 2013-103) ;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( No 2011-107)

收稿日期:2015－10－04，修回日期: 2015－11－03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0133－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．028