陳錫強(qiáng)，韓利文，王希敏，王榮春，侯海榮，劉可春，彭維兵，孫　晨，韓　建

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，山東濟(jì)南　250014)

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人乳腺癌斑馬魚移植瘤模型建立

陳錫強(qiáng)，韓利文，王希敏，王榮春，侯海榮，劉可春，彭維兵，孫晨，韓建

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，山東濟(jì)南250014)

中國(guó)圖書分類號(hào): R965．1; R737; R73-35

摘要:目的研究人乳腺癌斑馬魚移植瘤模型的建立方法及其相關(guān)的蛋白表達(dá)。方法分別選用MCF-7、T-47D、MDA-MB-231細(xì)胞系顯微注射至斑馬魚幼魚體內(nèi)，考察不同乳腺癌細(xì)胞系在斑馬魚體內(nèi)的定植遷移、細(xì)胞數(shù)量變化、細(xì)胞分布以及對(duì)斑馬魚腸下靜脈叢( subintestinal veins，SIVs)的影響，建立乳腺癌斑馬魚移植瘤模型;并考察JAK抑制劑對(duì)斑馬魚移植腫瘤的影響，并對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的情況進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果在接種細(xì)胞數(shù)大于每只200時(shí)，斑馬魚的腫瘤模型成功率大于比例0. 90; MB-231移植瘤在斑馬魚體內(nèi)具有明顯的遷移特征，這種特征可被JAK抑制劑tofacitinib抑制( P＜0. 01) ;同時(shí)tofacitinib可明顯減少移植瘤模型體內(nèi)MB-231的數(shù)量( P＜0. 01) ;移植瘤可促進(jìn)SIVs增生，酪氨酸抑制劑PTK787可明顯地抑制移植瘤引起的SIVs的生長(zhǎng)( P＜0. 01) ;蛋白印跡結(jié)果顯示，4 d斑馬魚胚胎自身HER2有表達(dá)，T-47D斑馬魚模型組組織中HER2表達(dá)增加; MB-231斑馬魚模型組組織中VEGFa高表達(dá); tofacitinib處理后的移植瘤其p53表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論人源腫瘤通過(guò)微量顯微注射方法可成功建立斑馬魚乳腺癌移植瘤模型，該模型可用于抗腫瘤藥物的初步篩選研究。

關(guān)鍵詞:斑馬魚;移植瘤模型;乳腺癌;血管生成;抑制劑; tofacitinib

劉可春( 1964－)，男，博士，研究員，通訊作者，Tel: 86-0531-82605352，E-mail: hliukch@ sdas．org

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢(shì)。據(jù)《2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》公布的乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示:全國(guó)腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率(粗率)全國(guó)合計(jì)為42. 55/10萬(wàn)。經(jīng)過(guò)30多年的研究，斑馬魚已經(jīng)成為一種公認(rèn)的模式動(dòng)物，由于其繁殖周期短、胚胎早期透明、并在系統(tǒng)的發(fā)育、功能及疾病模型方面取到了豐富的研究結(jié)果［1－2］，近幾年斑馬魚的移植瘤動(dòng)物模型在國(guó)際上剛剛興起，尤其是移植瘤在腫瘤遷移機(jī)制的研究方面成為了廣泛接受的模型。利用微量注射的方法，將人/鼠腫瘤移植入斑馬魚的腹腔中［3－4］，這種新模型在腫瘤增殖機(jī)制、腫瘤遷移基因研究、藥物活性評(píng)價(jià)等方面都有報(bào)道，這些探索性的研究對(duì)高通量篩選提供了新的工具和新的研究思路，對(duì)新藥的發(fā)掘具有重大的意義。本文研究建立以斑馬魚為動(dòng)物載體，建立斑馬魚乳腺癌移植瘤模型，并對(duì)模型的生長(zhǎng)特性、促血管生成、相關(guān)蛋白表達(dá)及抑制劑的作用進(jìn)行初步的研究。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株實(shí)驗(yàn)瘤株:乳腺癌MCF-7由自中國(guó)海洋大學(xué)惠贈(zèng)，乳腺癌T-47D與MDA-MB-231均為聊城大學(xué)惠贈(zèng)，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，傳代，常規(guī)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用野生型AB型斑馬魚與血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg( VEGFR2: GFP)，系山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)提供。

1．2實(shí)驗(yàn)儀器與耗材L-15、DMEM培養(yǎng)基與新鮮牛血清購(gòu)自( GIBCO，批號(hào)分別為1300045、1122050; 0．25%胰酶-EDTA購(gòu)自GIBCO(批號(hào)為1535318)，青霉素鈉與鏈霉素購(gòu)自上海生工，酪氨酸酶抑制劑PTK787( Vatalanib)及麻醉劑三卡因( A5040)購(gòu)自SIGMA- ALDRICH; JAK抑制劑tofacitinib( S500105)購(gòu)自Selleck，脫膜劑pronase E購(gòu)自Solarbio，CM-DiL活細(xì)胞染色劑( C7000，Invitrogen) ;微量注射儀ZGENEBIO PCO-1500購(gòu)自力鈞生物科技有限公司，激光掃描共聚焦顯微鏡FV-1000來(lái)自O(shè)LYMPUS，伯樂(lè)Chemiodc XPS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，無(wú)菌操作臺(tái)SW-CJ-2來(lái)自蘇州AIRTECH，5804R離心機(jī)由Eeppendorf提供，體視顯微鏡選用重慶光學(xué)儀器公司ZSA302。

2　方法

2．1斑馬魚胚胎的獲取選用成熟♀♂斑馬魚分開喂養(yǎng)，照明14 h/黑暗10 h交替進(jìn)行，定時(shí)飼喂混合餌料;采胚胎時(shí)，取性成熟斑馬魚，按照♀∶♂=1∶1～3放入交配缸中，于次日10時(shí)獲得受精卵。對(duì)受精卵進(jìn)行消毒和清洗后，加入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水中，置于28℃光照培養(yǎng)箱待用。

2．2乳腺癌細(xì)胞系微量注射前準(zhǔn)備在受精卵發(fā)育24 h時(shí)，使用1 g·L－1Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，備用。無(wú)菌條件下將培養(yǎng)瓶中乳腺癌細(xì)胞除去培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，加入胰酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化，離心后換新的培養(yǎng)基，每毫升細(xì)胞懸液加入活細(xì)胞染色劑CM-DiL 7. 5 μL，37℃孵育5 min，然后在冰箱4℃孵育15 min，離心除去上清液，PBS清洗2次后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基復(fù)懸，鏡下調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到3×108·L－1。

2．3微量注射條件參照Yong-Teng的實(shí)驗(yàn)方法［5］，選用新配制0. 03%苯硫脲(抑制色素形成)孵育48 h pf的斑馬魚胚胎準(zhǔn)備微量注射，加入適量三卡因輕度麻醉，放置在體視顯微鏡下，將不同濃度CM-dil染色后的乳腺癌細(xì)胞注射于胚胎卵黃囊后部，約0. 05～0. 2 μL，注射后斑馬魚用無(wú)菌水清洗，放入28℃培養(yǎng)箱。6 h后將死亡斑馬魚吸出，隨機(jī)分為模型組( micro-injection，micro-IJ)與用藥組，用藥組分別加入血管生成抑制劑PTK787或者JAK抑制劑tofacitinib，藥物處理48 h后，將幼魚麻醉后在共聚焦鏡下拍照，并用FV-10軟件分析紅色腫瘤細(xì)胞光密度( optical density，OD)。

2．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法腸下靜脈分析方法:參照文獻(xiàn)方法改進(jìn)［4］，對(duì)腫瘤引起的對(duì)腸下靜脈進(jìn)行拍照，并用FV-10軟件測(cè)量腸下靜脈面積。移植瘤遷移評(píng)價(jià)方法:參照Ghotra等［6］的試驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，以斑馬魚卵黃囊后1/3處注射點(diǎn)為原點(diǎn)，按照周邊移植瘤劃出直線距離，利用軟件Image J 1. 43測(cè)量各個(gè)遷移細(xì)胞的遷移距離，計(jì)算總距離，數(shù)據(jù)用Graphpad prism 5. 0處理。各組幼魚逐條檢測(cè)剔除失敗樣本。

2．5Western blot分析在熒光鏡下計(jì)數(shù)結(jié)束后，取出斑馬魚，魚體粉碎勻漿，加入組織蛋白提取液，勻漿后冰浴靜置20 min，然后4℃離心10 min，得上清液為蛋白提取液。分光光度計(jì)測(cè)定蛋白量，取30 μg蛋白提取液，按照體積1∶1加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后把分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。與兔抗鼠HER2抗體( 1∶1 000) 4℃過(guò)夜孵育。TBST洗滌后，加入羊抗兔IgG二抗( 1∶8 000)室溫孵育1 h。TBST充分洗滌2次后，ECL顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。利用Image J軟件測(cè)條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白HER2的灰度比值。p53、VEGFa和β-actin的檢測(cè)方法過(guò)程與HER2相同。

2．6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS13. 0對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3．1乳腺癌細(xì)胞斑馬魚移植瘤成瘤性的生長(zhǎng)特點(diǎn)斑馬魚微量注射乳腺癌細(xì)胞48 h后，各組死亡率介于5%～15. 7%，低于文獻(xiàn)報(bào)道0. 3～0. 4［7］;不同細(xì)胞系每個(gè)胚胎50 ～200個(gè)腫瘤細(xì)胞注射完畢后，移植成功率隨數(shù)量增加而增加，在200/只時(shí)造模成功比例超過(guò)0. 90。各模型呈現(xiàn)出不同的遷移規(guī)律: MCF-7呈現(xiàn)全身分布，在卵黃尾部與主動(dòng)脈區(qū)域有分布; T-47D的分布較為局限，主要在卵黃區(qū)域及心臟分布; MDA-MB-231在斑馬魚胚胎全身均有分布，主要在循環(huán)系統(tǒng)附近分布。

3．2tofacitinib對(duì)斑馬魚移植瘤的影響模型組在微注射48 h后，模型組鏡下可見MB-231紅色腫瘤細(xì)胞在胚胎各個(gè)器官均有分布，較集中于卵黃部、卵黃延伸部，少量分布于頭部;用藥組紅色腫瘤細(xì)胞全身分布的情況消失，紅色細(xì)胞量減少且分布區(qū)域局限，或者僅局限于卵黃延伸部( Fig 2C、D) ; OD值顯示micro-IJ組與0. 04/0. 06 mmol·L－1tofacitinib組比較在細(xì)胞數(shù)量及分布距離差異均具有顯著性( P＜0. 01)。

3．3腫瘤細(xì)胞對(duì)斑馬魚腸下靜脈增殖的影響共聚焦鏡下觀察顯示:正常對(duì)照組腸下靜脈呈弓形，柵欄狀，連續(xù)無(wú)分支，有少量出芽;微量注射模型組顯示腸下靜脈有明顯增生，靜脈彎曲延長(zhǎng)，出現(xiàn)側(cè)枝與分支，部分區(qū)域呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)可見魚體內(nèi)紅色腫瘤細(xì)胞;與模型組比較，PTK787組腸下靜脈叢OD明顯減少，出芽及側(cè)枝數(shù)量減少，用藥組模型組與空白對(duì)照組、用藥組比較差異有顯著性( Fig 3D)。

Fig 1 Modeling of human breast cancer in zebrafish

3．4蛋白印跡分析結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞T-47D細(xì)胞移植進(jìn)入斑馬魚胚胎后，雖然AB胚胎在4 d自身有HER2表達(dá)，在T-47D細(xì)胞移植進(jìn)入后，HER2表達(dá)量增加; MB-231細(xì)胞系移植后，VEGFa的量增加;在tofacitinib處理后的移植瘤胚胎，其p53表達(dá)量明顯增加。

4　討論

目前采用的乳腺癌的小鼠/大鼠模型是最經(jīng)典的動(dòng)物疾病模型，但是其成本高，周期長(zhǎng)，需要輔助雌激素緩釋刺激成瘤，操作繁瑣［8－9］;乳腺癌的體外實(shí)驗(yàn)雖然操作簡(jiǎn)便，成本低，但與腫瘤體內(nèi)增殖，遷移的規(guī)律差異較大，作為在體實(shí)驗(yàn)的有益補(bǔ)充。斑馬魚移植瘤模型是近年來(lái)移植瘤模型研究熱點(diǎn)，在藥物研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用［10－12］，斑馬魚移植腫瘤模型具有成本較低、實(shí)驗(yàn)周期短( 4～7 d)，受精后1周內(nèi)無(wú)明顯免疫系統(tǒng)排異反應(yīng)［13］，移植癌細(xì)胞清晰可見等優(yōu)點(diǎn);目前斑馬魚腫瘤移植主要采用胚胎期的幼魚，并多見于腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因功能研究與抗腫瘤的藥物篩選研究［14］;該模型兼顧了在體模型與體外實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)，減少了時(shí)間和成本，并滿足了腫瘤在體微環(huán)境的要求。

Fig 2 Xenografts in zebrafish larva after treatment with different concentrations of tofacitinib(±s)

在本研究發(fā)現(xiàn)不同類型的乳腺癌細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)均能生長(zhǎng)良好，但在遷移特性方面差異較大: MDA-231、MCF-7腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移性，注射后48 h在胚胎多個(gè)部位有出現(xiàn)，與文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似［15］;而T-47D腫瘤細(xì)胞遷移則不明顯，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了移植瘤癌模型建立的成功率與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)系，與較早的報(bào)道相同［16］，細(xì)胞系自身特性對(duì)斑馬魚體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的的遷移有直接影響。

Fig 3 Lateral view of xenograft TG zebrafish showing SIVs after treatment with PTK787 pass micro-IJ 48 h

乳腺癌HER2高表達(dá)和乳腺癌低生存率間有顯著的關(guān)聯(lián)，HER2基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平是乳腺癌的診斷指標(biāo)和預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物［17－18］。而從Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HER2在斑馬魚胚胎早期發(fā)育階段有表達(dá)，從受精后10h至成年均有表達(dá)，而且在魚鰭、神經(jīng)系統(tǒng)及鰭再生中發(fā)揮重要作用［19］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HER2高表達(dá)的T-47D細(xì)胞移植后可增加斑馬魚HER2表達(dá)。同樣人源腫瘤細(xì)胞的進(jìn)入魚體后促進(jìn)SIVs的數(shù)量明顯性的增加，并且VEGF的表達(dá)增強(qiáng);同時(shí)斑馬魚模型的標(biāo)記VEGFR2熒光血管數(shù)量增加，從而反應(yīng)出VEGFR2表達(dá)也增強(qiáng)，說(shuō)明移植瘤對(duì)VEGF配體/受體具有同時(shí)增強(qiáng)的作用，其對(duì)血管生成的促進(jìn)作用強(qiáng)于單個(gè)促血管生成因子的實(shí)驗(yàn)作用，而且這種作用可被酪氨酸酶抑制劑PTK787抑制。研究發(fā)現(xiàn)JAK1或JAK2敲除的人源癌細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的遷移能力都會(huì)變?nèi)酰?］，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)JAK抑制劑確實(shí)能夠抑制細(xì)胞的遷移，同時(shí)它可減少魚體內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞數(shù)量，并增強(qiáng)p53表達(dá)，表明tofacitinib除了對(duì)JAK/stat3通路有抑制作用外，抑制在體腫瘤細(xì)胞的作用與p53通路有關(guān)。

Fig 4 Western blot assay of zebrafish xenografts 48 h after injection

斑馬魚移植瘤模型的制作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性佳、周期短，其自身比例0. 80基因與人具有保守性［20］，在多種癌細(xì)胞的遷移研究和藥物活性評(píng)價(jià)方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，雖然斑馬魚胚胎移植瘤無(wú)乳腺組織，無(wú)法做到組織器官發(fā)病，但腫瘤細(xì)胞在斑馬魚胚胎中的存活、促血管生成、遷移特征、及相關(guān)分子的表達(dá)都具有較高相似度;同時(shí)腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)因子如VEGF、HER2等重要靶點(diǎn)與人類有較高的保守性，對(duì)于靶點(diǎn)藥物的評(píng)價(jià)展示了良好的適用性，因而在抗腫瘤的應(yīng)用研究中得到認(rèn)可，從目前的研究來(lái)看，隨著該模型的不斷深入研究，作為移植瘤模型其具有廣闊的研究?jī)r(jià)值，并且在藥物篩選方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

(致謝:本文所有試驗(yàn)均在山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選室及生物公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成并感謝中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院和聊城大學(xué)生物研究中心提供細(xì)胞系。)

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Model establishment of xenotransplantation of human breast cancer in zebrafish embryos

CHEN Xi-qiang，HAN Li-wen，WANG Xi-min，WANG Rong-chun，
HOU Hai-rong，LIU Ke-chun，PENG Wei-bing，SUN Chen，HAN jian
( Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensor，Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Ji’nan 250014，China)

Abstract:AimTo investigate the modeling of breast cancer in zebrafish embryos and its related protein expression．Methods 48hpf wild type AB/TG( Transgenic) zebrafishs were micro-injected with breast cancer cell line: MCF-7，T-47D，MDA-MB-231 respectively，the relationship between the number of tumor and model application was investigated，and the number of subintestinal veins( SIVs) was detected under confocal microscope，as well as the metastasis of tumor cells in embryos; then the zebrafish xenografts of MB-231 were co-cultured with tofacitinib/ ptk787 for 48 h，optical density( OD) of the cell survival and subintestinal veins( SIVs) were evaluated under confocal microscope，and Western blot( WB) analysis was used to test microcircumstances related protein．Results When the number of inoculated cells was more than 200 per embryo，xenograft model rate woule be more than 0. 90; MB-231 xenografts showed metastasis feature in zebrafish，which could be inhibited by tofacitinib ( P＜0. 01)，while the number of xenograft MB-231 cells was reduced significantly( P＜0. 01) ; in another zebrafish xenografts SIVs assay，the tumor could promote the proliferation of SIVs，and 4 mg·L－1PTK787 showed inhibiton effect( P＜0. 01)．Western blot showed 4d T-47D xenograft zebrafish got more HER2 expression than AB embryos; VEGFa expression in zebrafish MB-231 model group was higher，and model zebrafish P53 expressi was higher after treated by tofacitinib．Conclusion

A zebrafish xenograft model of human brest cancer can be established，which demonstrates applicability for screening compounds in drug discovery studies．

Key words:zebrafish; xenograft; breast cancer; angiogenesis; inhibitor; tofacitinib

作者簡(jiǎn)介:陳錫強(qiáng)( 1972－)，男，博士，助理研究員，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: cxqq@ sina．com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 81202584，31400979) ;山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)( No 2014ZZCX02105) ;山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目( No 2013GHY11516)

收稿日期:2015－09－02，修回日期: 2015－10－18

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0128－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．027