夏寶妹，陳　暢，張海樓，薛文達(dá)，吳如燕，任　荔，陶偉偉，陳　剛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京　210023; 2.南京市江寧中醫(yī)院，江蘇南京　210023)

?

越鞠甘麥大棗湯對產(chǎn)后抑郁小鼠海馬AKT/mTOR信號通路的影響

夏寶妹1，陳暢2，張海樓1，薛文達(dá)1，吳如燕1，任荔1，陶偉偉1，陳剛1

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023; 2.南京市江寧中醫(yī)院，江蘇南京210023)

中國圖書分類號: R-332; R282．71; R289．5; R322．81; R714. 46; R749. 420. 531

摘要:目的以慢性孕前應(yīng)激誘導(dǎo)建立產(chǎn)后抑郁癥小鼠模型，研究越鞠甘麥大棗湯(越甘)對產(chǎn)后抑郁母鼠的快速抗抑郁作用，并從海馬AKT/mTOR信號通路角度探討產(chǎn)后抑郁的發(fā)病機(jī)制以及中藥越甘快速治療產(chǎn)后抑郁癥的作用機(jī)制。方法將32只Bal b/c母鼠隨機(jī)分為2組，空白對照組，不給予任何刺激;孕前應(yīng)激組，小鼠給予慢性束縛刺激。3周后慢性孕前應(yīng)激組小鼠♀♂合籠交配懷孕，于分娩后3周檢測母鼠懸尾測試( tail suspension test，TST)。將產(chǎn)后抑郁模型組母鼠隨機(jī)分為3組:模型組、越甘組( YG)、氯胺酮組。檢測藥物對產(chǎn)后抑郁母鼠的干預(yù)作用，并取母鼠海馬檢測AKT、mTOR磷酸化蛋白( phosphorylation protein)以及總蛋白的表達(dá)。結(jié)果產(chǎn)后3周，與對照組比較，PPD模型組在懸尾測試中的絕望狀態(tài)不動時(shí)間明顯增加( P＜0. 01)。與對照組相比，PPD模型組母鼠海馬AKT、mTOR磷酸化蛋白表達(dá)均下調(diào)，且差異具有顯著性( P＜0. 01，P＜0. 01)。單次給予越甘或氯胺酮24 h之后，PPD模型母鼠懸尾測試的絕望不動時(shí)間明顯降低( P＜0. 01，P＜0. 01)，并且海馬AKT、mTOR磷酸化蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)( P＜0. 01，P＜0. 01)，( P＜0. 01，P＜0. 01)。結(jié)論慢性孕前應(yīng)激可誘導(dǎo)Balb/c母鼠表現(xiàn)出產(chǎn)后抑郁樣癥狀，其發(fā)病機(jī)制可能與下調(diào)海馬AKT/mTOR信號通路的蛋白表達(dá)有關(guān)。在此產(chǎn)后抑郁模型上，中藥越甘具有與西藥氯胺酮一致的快速抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)AKT/mTOR信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞:產(chǎn)后抑郁;越鞠甘麥大棗湯;快速抗抑郁; AKT; mTOR ;氯胺酮

陳剛( 1972－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:抑郁癥的中醫(yī)藥機(jī)制，通訊作者，Tel: 025-85811160，E-mail: chengang@ njutcm．edu．cn

產(chǎn)后抑郁癥( postpartum depression，PPD)是產(chǎn)褥期精神綜合征中最常見的一種類型，以分娩后出現(xiàn)情緒低落、精神抑郁為主要癥狀，臨床以沮喪、悲傷、哭泣、易煩躁、易激動，甚至出現(xiàn)幻覺，或有自殺及傷嬰等一系列表現(xiàn)［1］。PPD不僅存在抑郁，且常與許多軀體疾病相關(guān)聯(lián)，嚴(yán)重危害產(chǎn)婦及嬰兒身心健康，給家庭和社會也帶來嚴(yán)重影響。

PPD的產(chǎn)生與多種因素相關(guān)，既往的應(yīng)激性生活事件被認(rèn)為是PPD發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素［2］。本研究團(tuán)隊(duì)前期以孕前應(yīng)激法構(gòu)建Bal B/C小鼠PPD模型，以朱丹溪“統(tǒng)治六郁”的方藥越鞠丸合《金匱要略》的甘麥大棗湯即越鞠甘麥大棗湯干預(yù)PPD模型，發(fā)現(xiàn)越甘對PPD模型小鼠具有與氯胺酮一致的快速抗抑郁作用［3］。

目前，國內(nèi)外對于快速抗抑郁的研究出現(xiàn)新的潛在的治療靶點(diǎn)，信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的缺陷和異常活化研究成為其中一個(gè)熱點(diǎn)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶( AKT) /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)信號通路被認(rèn)為是抑郁癥的一個(gè)發(fā)病機(jī)制，而研究證明西藥氯胺酮可通過AKT/mTOR信號通路發(fā)揮其快速抗抑郁作用［4］。AKT參與細(xì)胞成長、分化、損傷保護(hù)等過程。AKT磷酸化可改變活性，其水平可由很多因子調(diào)控，其中包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin，mTOR )家族。mTOR是細(xì)胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子。大量研究顯示mTOR信號通路調(diào)控異常與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。AKT磷酸化與mTOR相互調(diào)控，AKT磷酸化水平增加可上調(diào)mTOR的表達(dá)［5］。

本實(shí)驗(yàn)在前期產(chǎn)后抑郁動物模型構(gòu)建成功及藥物作用有效的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從AKT/mTOR信號通路的角度，探討產(chǎn)后抑郁癥海馬AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路的變化及中藥越甘對此信號通路的作用影響。

1　材料

1．1實(shí)驗(yàn)動物清潔級健康成年♀Bal B/C小鼠32只，體質(zhì)量18～24g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號: 2007000581303。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。動物房室溫25℃、濕度為45%，明暗交替時(shí)間為12 h，動物可以自由飲食，自由進(jìn)水。

1．2實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)驗(yàn)用中藥材購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診，經(jīng)本校藥學(xué)院專家鑒定，為中國藥典收載品種。越鞠甘麥大棗湯由蒼術(shù)100 g、香附100 g、神曲100 g、梔子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麥250 g、大棗375 g組成，上述藥物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h過濾，再加6倍量水按上法煎煮后過濾，合并兩次藥液，65℃減壓旋蒸濃縮，濃縮后的藥物終濃度為8. 3 g·kg－1。配好的藥物分裝在10 mL離心管內(nèi)，－20℃保存。鹽酸氯胺酮( ketamine，Ket)注射液為福建古田制藥廠生產(chǎn)(批號: 20140301)。臨用前用生理鹽水配成30 g·L－1的藥液。

2　方法

2．1動物分組及模型的制備小鼠隨機(jī)分為2組:空白對照組( n = 8)和孕前應(yīng)激模型組( n = 24)，空白對照組不予任何應(yīng)激，孕前應(yīng)激組小鼠給予每天6 h的束縛應(yīng)激刺激( am 11: 00～17: 00)。3周后將孕前應(yīng)激組以1♀1♂分籠交配飼養(yǎng)。大約4周后，母鼠分娩，被定義為PPD模型組。檢測行為學(xué)指標(biāo)以判斷造模是否成功。

將PPD模型組母鼠隨機(jī)分為3組:模型組( n = 8)，中藥越甘組( n =8)，西藥氯胺酮組( n = 8)。在產(chǎn)后21 d，越甘組以中藥越甘湯劑0. 1 mL·( 10 g)－1灌胃(相當(dāng)于每克小鼠給予越甘生藥0. 083 g) ;氯胺酮組以西藥氯胺酮注射液0. 1 mL·( 10 g)－1腹腔注射(相當(dāng)于每克小鼠給予氯胺酮0. 03 mg)。24 h后，檢測母鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。

2．2小鼠的行為學(xué)測試指標(biāo)懸尾實(shí)驗(yàn)( tail suspension test，TST) :采用上海吉量軟件公司的懸尾測試視頻分析系統(tǒng)，用膠帶將小鼠懸掛于距臺面30 cm的支架邊緣上，膠帶粘貼位置在距小鼠尾尖1cm處。每只小鼠共懸掛5min，記錄其在最后4min的不動時(shí)間，即小鼠在空中停止掙扎，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動。

2．3Western blot檢測小鼠海馬Akt/mTOR蛋白表達(dá)小鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，立即進(jìn)行冰上取腦，分離出海馬組織。將海馬組織稱重后，組織置于裂解液中勻漿10 min(重量體積比為1∶10)，勻漿后4℃12 000×g離心10 min，取上清，20 μL/管分裝，－70℃保存。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，取5 μL樣品/泳道上樣，分離膠濃度為8%。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上( 4℃300 mA電轉(zhuǎn)60 min)，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5% BSA室溫封閉膜1 h，分別用AKT/p-AKT ( Cell Signaling Technology，9272S，4058 S，1∶500)，mTOR/p-mTOR ( Cell Signaling Technology，2972S，2971S，1∶500)，兔抗βtubulin (北京中山金橋，1∶2 000)一抗4℃孵育過夜。次日TBST漂洗10 min×3次后，二抗( 1∶2 000)室溫孵育1 h后加入ECL發(fā)光底物顯色。Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影分析。用目的蛋白與各自β-tubulin蛋白灰度比值表示其蛋白量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3　結(jié)果

3．1PPD模型組母鼠懸尾測試的表現(xiàn)及越甘對其懸尾絕望不動時(shí)間的影響模型組母鼠絕望不動持續(xù)時(shí)間明顯增加，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)。單次給予YG能夠降低PPD模型組母鼠懸尾測試的不動時(shí)間，與氯胺酮效果一致( P＜0. 01)。YG組與氯胺酮組差異無顯著性。見Fig 1。

Fig 1 Immobility in TST of two groups of mice

3．2PPD模型組母鼠海馬AKT/mTOR信號通路的表達(dá)及越甘對Akt/mTOR信號通路的影響與對照組相比，模型組母鼠海馬p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01，P ＜0. 01)。單次給予YG能夠明顯上調(diào)PPD模型組母鼠海馬AKT/mTOR信號通路的蛋白表達(dá)( P＜0. 01，P＜0. 01)，與氯胺酮效果一致( P＜0. 01，P＜0. 01)。見Fig 2。

Fig 2 Changes in Akt/mTOR proteinexpression in two groups of mice

4　討論

本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)單次給藥越甘24 h后能夠明顯改善孕前應(yīng)激PPD小鼠模型的行為學(xué)指標(biāo)［3］。與模型組相比，越甘治療組可以明顯增加模型母鼠的糖水偏愛百分比，降低模型母鼠在強(qiáng)迫游泳測試的絕望不動時(shí)間，縮短模型母鼠陌生環(huán)境攝食測試中的潛伏時(shí)間和增加其單位時(shí)間內(nèi)攝食量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究進(jìn)一步以懸尾測試證實(shí)越甘可以明顯改善模型小鼠的絕望不動時(shí)間。在孕前應(yīng)激PPD小鼠模型上，越甘具有跟西藥氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。

氯胺酮目前被公認(rèn)為是可以用于治療難治性抑郁、具有快速持久抗抑郁作用的藥物［13］。在臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)上，單次亞麻醉劑量的氯胺酮具有快速持久的抗抑郁的作用［14－15］。但是，氯胺酮具有神經(jīng)毒性和成癮性等副作用，限制了其臨床使用。研究證明氯胺酮可以通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路發(fā)揮其快速抗抑郁作用［4］。AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要信號通路。AKT是一種PKC相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱蛋白激酶B( proteinkinase B，PKB)，有連接酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的作用。它可以被許多生長因子激活，參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［6－7］。AKT是促進(jìn)細(xì)胞生存和維持細(xì)胞正常功能關(guān)鍵的信息分子，并且構(gòu)成細(xì)胞對外應(yīng)激反應(yīng)過程中的促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞重要功能的信號傳遞鏈。激活后的AKT將信號傳遞給多種下游底物，從而控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)?；罨腁KT可提高海馬區(qū)的神經(jīng)再生。國外學(xué)者等發(fā)現(xiàn)20例重性抑郁癥自殺患者的腦組織中，AKT蛋白活性明顯降低［8］。另外還有學(xué)者報(bào)道AKT可增強(qiáng)海馬干細(xì)胞的功能，促進(jìn)抗抑郁藥物的療效［9］。

mTOR是AKT的重要底物之一。AKT通過直接和間接兩種途徑激活mTOR。mTOR通過控制其下游與翻譯和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的多種蛋白的磷酸化來發(fā)揮其生物學(xué)作用，在細(xì)胞的生存、生長和增殖中起中心調(diào)控作用。研究表明mTOR也具有促進(jìn)神經(jīng)再生作用［9－10］。有學(xué)者［4］發(fā)現(xiàn)氯胺酮的快速抗抑郁可能與其上調(diào)mTOR的表達(dá)，從而快速促進(jìn)神經(jīng)軸突再生有關(guān)。本課題組前期研究［11］也發(fā)現(xiàn)，在慢性應(yīng)激小鼠模型上，越鞠丸具有與氯胺酮相似的快速抗抑郁作用，其機(jī)制與調(diào)控AKT/mTOR信號通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示產(chǎn)后抑郁模型組小鼠海馬AKT、mTOR磷酸化蛋白表達(dá)均較正常組明顯下調(diào)，經(jīng)中藥越甘及西藥氯胺酮治療后，其表達(dá)均明顯上升，提示藥物的抗抑郁作用可能是通過激活A(yù)KT/ mTOR信號傳遞通路級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)存活功能，增強(qiáng)突觸傳導(dǎo)及神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)，逐步發(fā)揮抗抑郁的作用。這與國外學(xué)者的研究結(jié)果是一致的［12］，其發(fā)現(xiàn)氯胺酮治療抑郁癥患者后，病人外周血清中AKT、mTOR表達(dá)明顯上調(diào)。根據(jù)研究結(jié)果，我們推測中藥越甘快速治療產(chǎn)后抑郁癥的機(jī)制可能是通過調(diào)控海馬中AKT/mTOR信號通路，修復(fù)由抑郁導(dǎo)致下降的神經(jīng)突觸功能，從而促進(jìn)神經(jīng)再生，發(fā)揮快速抗抑郁作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR信號通路在產(chǎn)后抑郁癥模型動物海馬中異常表達(dá)，此信號通路可能與產(chǎn)后抑郁的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，中藥越甘可通過調(diào)控該信號通路發(fā)揮其快速治療產(chǎn)后抑郁癥的作用。我們對產(chǎn)后抑郁癥模型動物腦中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究將會進(jìn)一步闡明產(chǎn)后抑郁癥的潛在病理機(jī)制，了解快速抗抑郁藥物的作用位點(diǎn)，揭示中藥越甘快速治療產(chǎn)后抑郁癥的藥物機(jī)制，為臨床治療這種疾病提供更好的藥物選擇。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝。)

參考文獻(xiàn)

［1］張榮蓮，陳起燕，李艷華，等．產(chǎn)后抑郁癥發(fā)病因素的探討［J］．中華婦產(chǎn)科雜志. 1999，34( 4) : 231－3．

［1］Zhang R L，Chen Q Y，Li Y H，et al. Study for the factors related to postpartum depression［J］. Chin J Obstetrics Gynecol，1999，34 ( 4) : 231－3．

［2］Kendler K S，Kessler R C，Walters E E，et al. Stressful life events，genetic liability，and onset of an episode of major depression in women［J］. Am J Psychiatry，1995，152( 6) : 833－42．

［3］夏寶妹，張海樓，薛文達(dá)，等.產(chǎn)后抑郁小鼠模型的構(gòu)建及越鞠甘麥大棗湯對其抑郁樣行為的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31( 9) : 1324－8．

［3］Xia B M，Zhang H L，Xue W D，et al. Postpartum depression animal model in mice and the effect of the Yuejuganmaidazaotang on the PPD model［J］. Chin Pharmacol Bull，2015，31( 9) : 1324－8．

［4］Li N，Lee B，Liu R J，et al．mTOR－dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists ［J］．Science，2010，329( 5994) : 959－64．

［5］Obata T．Adenosine production and its interaction with protection of ischemic and reperfusion injury of the myocardium［J］．Life Sci，2002，71( 18) : 2083－103．

［6］Thompson J E，Thompson C B. Putting the Rap on Akt［J］．J Clin Oncol，2004，1522( 20) : 4217－26．

［7］Zhou H，Li X M，Meinkoth J，et al．Akt regulates cell survival and apotosis at a postmitochondrial level［J］．J Cell Biol，2000，151( 3) : 483－94．

［8］Karege F，Perroud N，Burkhardt S，et al. Alteration in kinase activity but not in protein levels of protein kinase B and glycogen synthase kinase-3beta in ventral prefrontal cortex of depressed suicide victims［J］. Biol Psychiatry，2007，61( 2) : 240－5．

［9］Kalkman H O．The role of the phosphatidylinositide 3-kinase-protein kinase B pathway in schizophrenia［J］. Pharmacol Ther，2006，110( 1) : 117－34．

［10］Saxe J P，Wu H，Kelly T K，et al．A phenotypic small-molecule screen identifies an orphan ligand-receptor pair that regulates neural stem cell differentiation［J］．Chem Biol，2007，14( 9) : 1019－30．

［11］Tang J J，Xue W D，Xia B M，et al．Fast-onset antidepressants normalize mTOR activity and NMDA receptor NR1 subunit expression in the prefrontal cortex of chronically stressed mice［J］．Sci Rep，2015，1－10．

［12］Denk M C，Rewerts C，Holsboer F，et al．Monitoring ketamine treatment response in a depressed patient via peripheral mammalian target of rapamycin activation［J］．Am J Psychiatry，2011，168 ( 7) : 751－2．

Effect of yuejuganmaidazaotang in hippocampus in postpartum depression model mice on AKT/mTOR signaling pathway

XIA Bao-mei1，CHEN Chang2，ZHANG Hai-lou1，XUE Wen-da1，WU Ru-yan1，REN Li1，TAO Wei-wei1，CHEN Gang1
( 1．Key Laboratory of Integrative Biomedicine of Brain Diseases，School of Basic Biomedical Science，2．Nanjing Jiangning Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

Abstract:AimUsing chronic pre-pregnancy stress to establish a postpartum depression animal model，given a single YG，and acute ketamine was served as control，to explore the pathology of PPD and the anti-depressive mechanism of the YG on the PPD model on AKT/ mTOR signaling pathway．MethodsThirty-two female Balb/c were randomly assigned to two groups，the control group ( Control，Con) and the pre-pregnancy stressed group( Model，Mod)，which was subjected to 3 weeks chronic restraint stress．After the last stressor，the pre-pregnancy stressed group was housed with a male. After about 4 weeks later，the mice gave birth to pups. Then at 3 weeks postpartum，we tested the maternal tail suspension test ( TST)．Both YG and Ketamine was single administered 24 hours before behavior test，with single saline for control group and PPD model group. After TST，the mouse hippocampus were extracted to detect the expression of AKTand mTOR. Results After 3 weeks postpartum，the model mice showed depression-like behaviors. Immobility in TST was significantly increased in vehicle groups( P＜0. 01) . Acute YG improved performance in the TST ( P ＜0. 01)，which was similar to ketamine. And the PPD model mice group showed decreased phosphorylation of AKT and mTOR ( P＜0. 01，P＜0. 01)，compared to control group. A single dose of YG or ketamine normalized AKT/mTOR signaling in the PPD model mice( P ＜0. 01，P＜0. 01)，( P＜0. 01，P＜0. 01)．Conclusions Chronic pre-pregnancy stress can induce dams into postpartum depression and its mechanism maybe associated with down-regulating AKT/mTOR signaling. Acute YG exerts fast antidepressant effect on this PPD model similar to ketamine，and its mechanism may be related to up-regulating AKT/mTOR signaling in the hippocampus．

Key words:postpartum depression; yuejuganmaidazaotang; rapid antidepressant; AKT; mTOR ; ketamine

作者簡介:夏寶妹( 1982－)，女，博士生，醫(yī)師，研究方向:抑郁癥的中醫(yī)藥研究，E-mail: babaysummer@163．com;

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 81403041) ;江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( BK20151565) ;江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科支持項(xiàng)目( PAPD)

收稿日期:2015－10－10，修回日期: 2015－11－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0119－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．025