陳林青 劉明軍 卓越 陳紹濤 于明超 仲叢文 李波王 蕾張欣

（長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長春130117）

束悗通經(jīng)推拿療法對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)功能與SOD表達(dá)的影響研究※

陳林青 劉明軍 卓越 陳紹濤 于明超 仲叢文 李波王 蕾張欣*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長春130117）

目的觀察“束悗通經(jīng)療法”對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)功能和SOD表達(dá)的影響。方法將80只大鼠隨機(jī)平均分為對照組、模型組、推拿組和藥物組，采用腹腔注射鏈脈佐菌素的方法造模，觀察各組動物坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNVC）和坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)的變化情況。結(jié)果對各組動物坐骨神經(jīng)SNVC檢測發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組比較，SNVC呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），推拿組與模型組比較，SNVC呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），藥物組與模型組比較，SNVC呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），推拿組與藥物組比較，SNVC無明顯差異（P＞0.05）；對各組動物坐骨神經(jīng)SOD檢測發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組比較，坐骨神經(jīng)中SOD表達(dá)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），推拿組與模型組比較，SOD表達(dá)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），藥物組與模型組比較，SOD表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論“束悗通經(jīng)推拿療法”能夠有效改善DPN大鼠模型下肢坐骨神經(jīng)SNVC，表明對周圍神經(jīng)功能恢復(fù)具有積極的促進(jìn)作用；同時“束悗療法”能夠提高坐骨神經(jīng)中SOD的表達(dá)，表明具有抗氧化的作用從而發(fā)揮保護(hù)坐骨神經(jīng)形態(tài)功能的療效。本研究將為糖尿病周圍神經(jīng)病變提供新的輔助治療手段，也為“束悗通經(jīng)推拿療法”的推廣普及奠定實驗室基礎(chǔ)。

推拿；束悗；糖尿病；周圍神經(jīng)病變；SOD表達(dá)；消渴；動物實驗

“束悗通經(jīng)推拿療法”是國家中醫(yī)藥管理局首批評選的中醫(yī)學(xué)術(shù)流派“長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派”的代表性手法之一。本法操作選取四肢大血管或大神經(jīng)干走行線路為施術(shù)部位，以手指或手掌按壓局部并停留一定時間為主要操作手法，然后采用“緩按快放”或“快按緩放”的方式放開按壓部位以推動局部氣血運(yùn)行，達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、活血止痛的治療目的，是一種中醫(yī)傳統(tǒng)推拿操作手法的創(chuàng)新[1]。本研究以“束悗通經(jīng)推拿療法”為主要干預(yù)手段，通過觀察糖尿病周圍神經(jīng)病變模型大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNVC）、坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)的改善情況開展相關(guān)機(jī)制研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與分組選取雄性wistar大鼠80只，鼠齡8周，由長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，每籠10只，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠糧。

按完全隨機(jī)設(shè)計法（隨機(jī)數(shù)字表）將大鼠分為4組：即空白對照組（簡稱對照組）、模型組、模型＋推拿干預(yù)組（簡稱推拿組）、模型＋藥物干預(yù)組（簡稱藥物組）。每組動物20只。

1.2 實驗藥品與試劑鏈脈佐菌素（美國sigma公司，1 g/瓶）；彌可保（甲鈷胺注射液，衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司，500 ug/支）；丙二醛測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實驗儀器推拿手法測定儀（TAP-Ⅱ型，上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)發(fā)展有限公司）；Medlab-u/4cs生物信號采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司；光學(xué)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）；酶標(biāo)儀：（BIO-RAD，美國）。

2 實驗方法

2.1 動物模型的制備取實驗大鼠60只，將鏈脈佐菌素臨用前用PH值4.2～4.5的0.1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液避光條件下配成1%濃度溶液，按劑量50 mg/kg于實驗大鼠左下腹腔內(nèi)單次注射，72小時后取尾血測血糖，凡血糖＞16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠。血糖未達(dá)標(biāo)的造模大鼠，補(bǔ)打30 mg/kg0.1%鏈脲佐菌素，72 h后測血糖，不足要求則棄去。如此在1周后血糖仍＞16.7 mmol/L，且從形態(tài)上有周圍神經(jīng)病變出現(xiàn)，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）明顯降低時，即制成周圍神經(jīng)病變模型大鼠。另取實驗大鼠20只，用0.1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液（PH4.2、4℃）按同體積左下腹腔內(nèi)單次注射，72小時后取尾血測血糖，作為正常對照組。

2.2 干預(yù)方法（1）推拿組：將實驗大鼠仰臥，固定其頭部與上肢。施術(shù)者以左手牽拉大鼠一側(cè)下肢，使下肢伸直呈水平位，以右手拇指指腹緩慢按壓于大鼠腹股溝處，力量經(jīng)推拿手法測試儀測定約為1 kg，持續(xù)30 s左右，然后突然抬手，停止按壓，即“緩按快放”；間隔60 s左右，再次以右手拇指指腹快速按壓于大鼠腹股溝處，力量經(jīng)推拿手法測試儀測定約為1 kg，持續(xù)30 s左右，然后緩慢抬手，停止按壓，即“快按緩放”。如此操作3次。以上治療方法每日早晚操作2次，共治療8周。（2）藥物組：將實驗大鼠仰臥，捆綁固定，每日1次，每次10分鐘。根據(jù)人與動物體表面積計算法換算注射彌可保，大鼠用藥量為50μg/kg，隔日注射于下肢肌肉，左右腿交替注射，以利于吸收，共治療8周。（3）對照組和模型組：將實驗大鼠仰臥，捆綁固定，每日1次，每次10分鐘，共8周。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 檢測指標(biāo)（1）實驗大鼠一般情況；（2）實驗大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNVC）；（3）實驗大鼠坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)。

2.3.2 檢測方法將實驗大鼠治療8周后尾靜脈取血以檢測血糖。以電子秤稱取每只大鼠體重后，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）進(jìn)行麻醉，將大鼠俯臥固定于固定架上，暴露出坐骨神經(jīng)，用無菌玻璃剝離器輕輕剝離坐骨神經(jīng)并游離下來，應(yīng)用生物信號采集處理系統(tǒng)，測得坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，然后迅速將坐骨神經(jīng)放入液氮中，放入-70℃冰箱中存放，以備勻漿使用。

2.4 數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0軟件包統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)之間的比較應(yīng)用方差分析，等級資料組間比較應(yīng)用秩和檢驗，檢驗的顯著水平為P＜0.05。

3 實驗結(jié)果

3.1 實驗大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）

表1 束悗療法對坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

表1 束悗療法對坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

注：與對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別例數(shù)SNCV（m/s）對照組20 35.47±2.65模型組18 25.66±2.84▲▲推拿組19 33.82±2.29★★藥物組18 32.17±2.73▲★★

通過表1可見，模型組與對照組比較，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），證明實驗造模成功。推拿組與模型組比較，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），藥物組與模型組比較，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），提示推拿“束悗療法”和藥物療法能夠有效改善DPN大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度；推拿組與藥物組比較，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度無明顯差異（P＞0.05）。

3.2 實驗大鼠坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）表達(dá)

表2 束悗療法對坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)的影響

表2 束悗療法對坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)的影響

注：與對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別例數(shù)SOD表達(dá)（U/mgprot）對照組20 32.86±5.33模型組18 21.07±6.49▲▲推拿組19 48.92±5.78▲▲★★藥物組18 23.26±6.43▲

通過表2可見，模型組與對照組比較，坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），證明實驗造模成功。推拿組與模型組比較，坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），提示推拿療法能夠有效提高坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)；藥物組與模型組比較，坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），提示藥物療法對坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)無明顯影響。

5 討論

束悗通經(jīng)推拿療法來源于傳統(tǒng)推拿療法束悗療法，其最早記載見于《內(nèi)經(jīng)》。在《靈樞·雜病》中記載：“痿厥為四末束悗，乃疾解之，日二，不仁者，十日而知，無休。病已止。”主要的意思是在治療痿厥癥病人時，將患者四肢捆綁起來，待其產(chǎn)生憋悶脹痛感覺后，迅速解開，每天治療兩次，原本四肢沒有知覺的患者在治療十天之后就會產(chǎn)生知覺，這種治療方法不要停止，直到患者痊愈為止。可見，束悗療法中的“束”，意為約束，束縛；“悗”，《辭?！方忉尀椤盁灐保鹅`樞·五亂》中記載有“清濁相干，亂于胸中，是謂大悗”。由此引申束悗具有約束阻滯之意?！鹅`樞集注》中曾批注“夫按之束之，皆導(dǎo)引之法，猶尺蠖之欲伸而先屈也”。可見，在治療氣機(jī)不暢、麻痹不仁的病癥時，可以在四肢脈位運(yùn)用束悗按抑的手法，達(dá)到通郁開閉、導(dǎo)氣通達(dá)的治療目的。然而，現(xiàn)代推拿臨床中，源于中醫(yī)傳統(tǒng)古籍的束悗療法卻鮮有應(yīng)用，僅散見于個別理論性的文獻(xiàn)探討中[2]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病性周圍神經(jīng)病變（DPN）的病理表現(xiàn)一是營養(yǎng)神經(jīng)的血管出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞增生或基底膜增厚；二是神經(jīng)本身出現(xiàn)病變，主要表現(xiàn)為神經(jīng)纖維軸索的損傷或構(gòu)成髓鞘或神經(jīng)內(nèi)膜的施萬細(xì)胞的變性壞死[3-4]。中醫(yī)則認(rèn)為，DPN屬于“痹證”“痿證”之范疇，多由于氣虛失運(yùn)、血虛不榮、痰瘀阻滯或風(fēng)濕痹阻等原因?qū)е戮植垦骶徛鲎杳}道，皮肉經(jīng)脈失去氣血濡養(yǎng)而痿廢不用[5-6]。這與糖尿病性周圍神經(jīng)病變（DPN）所表現(xiàn)出來的臨床癥狀是相吻合的。課題組在也曾在臨床上以“束悗療法”輔助治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變并取得滿意療效[1]。

神經(jīng)電生理檢查是早期診斷糖尿病并發(fā)周圍神經(jīng)病變的敏感指標(biāo)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢是糖尿病出現(xiàn)神經(jīng)病變的一個先兆，常常用于評價臨床療效與預(yù)后情況。運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNVC）反映坐骨神經(jīng)運(yùn)動的功能狀態(tài)，是研究實驗性DPN最常用的觀察指標(biāo)。有研究表明，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)高血糖后，高糖引起線粒體中的超氧陰離子增多，誘發(fā)周圍細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終造成糖尿病的各種慢性并發(fā)癥[10]。自由基是反映機(jī)體氧化應(yīng)激的直接指標(biāo)，但是自由基具有短瞬即逝的特性，實驗中難以測定。但是，一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA自由基損傷的終產(chǎn)物作為反映氧化應(yīng)激的可靠指標(biāo)和間接指標(biāo)則能夠檢測到。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部重要的自由基清除酶，其表達(dá)的高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力[11-12]。

通過對實驗結(jié)果的研究，課題組發(fā)現(xiàn)“束悗通經(jīng)推拿療法”能夠有效改善DPN大鼠模型下肢坐骨神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNVC），表明對周圍神經(jīng)功能恢復(fù)具有有效的促進(jìn)作用；同時能夠提高坐骨神經(jīng)中超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)，表明具有抗氧化的作用從而發(fā)揮保護(hù)坐骨神經(jīng)形態(tài)功能的療效。本研究將為糖尿病周圍神經(jīng)病變提供新的輔助治療手段，也為“束悗通經(jīng)推拿療法”的推廣普及奠定實驗室基礎(chǔ)。

[1]劉鵬，張燕，李躍宗.“束悗療法”治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，29(5):880-881.

[2]曠時恩，曠晉.束悗療法在傷病治療的臨床應(yīng)用[J].中華推拿療法雜志，2004，2(4):15-16.

[3]沈薇，董繼宏，汪聽.糖尿病周圍神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)制及治療展望[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2008，16(2):204-207.

[4]Laybutt DR，Kaneto H，Hasenkam PW，et al.Inereased expression of antioxidant and antiapoptotic genes in islets that may contribute top-cell survival during chronic hyperglycemia[J].Diabetes，2002，51(2):413-423.

[5]逄紫千，謝占峰，閻慧.針刺對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠尾神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27(4):523-525.

[6]逄紫千，閻慧，解占峰.針刺對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，28(4):594-596.

[7]Raekietan N，Raekietan ML，Nadkarni MR.Studies on diabetogenic action of Stre-Ptozotoein(NSC-37917).Caneer ChemotheraPy RePorts，1963，29:91-98.

[8]于德民，吳銳，尹雑，等.實驗性鏈脲佐菌素糖尿病動物模型的研究[J].中國糖尿病雜志，1995，3(2):105-109.

[9]黃繼漢，黃曉陣，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(9):1069-1072.

[10]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complieations:a unifying methanism[J].Diabeties，2005，54(6):1615-1625.

[11]Ceriello A，BortolottiN，F(xiàn)alleti E，et al.Total radiealtrapping antioxidant Parameter in NIDDM，Patients[J].Diabetes Care，1997，20:194-197.

[12]Blaszczak R，Klljawski K，Kedziora-Kornatowska K，et al.The tota antioxidant capacity and 1ow-molecula rantioxidant concentration in plasma of type-2 dsabetes patients with different stage of metabolic compensation and concomitant diabetic nephropathy[J].Pol Merkuriusz Lek，2005 Jan，18(103):29-32.

Effect of the Traditional Tuina Therapy of Shumantongjing on Diabetic Peripheral Neuropathy in Rats Model of Sciatic Nerve of SNVC and SOD Expression

CHEN Linqing, LIU Mingjun, ZHUO Yue, CHEN Shaotao, YU Mingchao, ZHONG Congwen, LI Bo,WANG Lei, ZHANG Xin
(College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Objective To observe the effect of the traditional Tuina therapy of ShumanTongjing on diabetic peripheral neuropathy in rats model of sciatic nerve of SNVC and SOD expression.Methods 80 rats were randomly divided into control group,model group, Tuina group and drug group.The peritoneal injection of STC was used to prepare the rats of diabetic peripheral neuropathy.The SNCV of the sciatic nerve and the SOD in the sciatic nerve were observed.Results In the SNVC detection,SNVC showed a significant difference between the control group and the model group(P<0.01),SNVC showed a significant difference between the tuina group and the model group(P<0.01),SNVC showed a significant difference between the drug group and themodel group (P<0.01),there was no significant difference in SNVC between the Tuina group and the drug group(P>0.05).In the SOD expression detection,SOD expression showed a significant difference between the control group and the model group(P<0.01), SOD expression showed a significant difference between the Tuina group and the model group(P<0.01),SOD expression showed no significant difference between the drug group and the model group(P>0.05).Conclusion The traditional Tuina therapy of Shuman Tongjing can effectively improve the SNVC of sciatic nerve,and it showed that Tuina has positive effects on peripheral nerve functional recovery.Tuina therapy of Shuman Tongjing can improve the expression of SOD in sciatic nerve,and it showed that Tuina has antioxidant effect so as to play a protective efficacy of morphology and function of sciatic nerve.This study will provide a new means for the treatment of diabetic peripheral neuropathy,and will lay the foundation for the promotion of the traditional Tuina therapy of Shuman Tongjing.

Tuina;Shuman;diabetes;peripheral neuropathy;SOD Expression;consumptive thirst;animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.05.067

1672-2779（2016）-05-0135-03

：楊杰本文校對：李波

2016-01-08）

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項目（No：20130101137JC）；吉林省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)基金項目（No：2014-Q31）；吉林省教育廳高?？茖W(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項目（No：2015-348）

*通訊作者：1147346490@qq.com