周紅祖，周禹練，余惠旻△

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518020;2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518060)

左金方和5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及BAX/Bcl-2表達(dá)的調(diào)控研究*

周紅祖1，周禹練2，余惠旻2△

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518020;2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518060)

目的:研究左金方和5-FU單獨(dú)與聯(lián)合對(duì)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響及對(duì)BAX/Bcl-2蛋白表達(dá)水平的改變。方法:將不同濃度的左金方、5-FU及兩藥聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞MGC803，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖率的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)bcl-2、bax蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.00 ug·mL－1左金方、50.00、100.00 ug·mL－15-FU作用GES-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(107.54± 2.25)%、(53.67±1.91)%和(47.43±1.35)%，作用MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)%;左金方聯(lián)合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00+100.00)作用GES-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(81.66±2.22)%和(78.68±2.10)%，作用MGC803細(xì)胞24 h后，相應(yīng)的凋亡率為(61.30±1.71)%和(71.30±1.79)%，與單獨(dú)用藥比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot凝膠電泳圖可以看出，左金方聯(lián)合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00 +100.00)作用MGC803細(xì)胞24 h后，進(jìn)一步促進(jìn)Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，與各單獨(dú)用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:左金方與5-FU聯(lián)合用藥有大幅降低5-FU細(xì)胞毒性作用，顯著提高人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的存活率;通過(guò)促進(jìn)MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)，促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的凋亡。

左金方;5-FU;GES-1;MGC803;聯(lián)合用藥;凋亡

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1-2］，目前尚無(wú)廣泛治療作用的抗胃癌中藥制劑問(wèn)世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，目前臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍的治療［3］。近年來(lái)，研究還發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用［4-5］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，左金方能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)胃腺癌細(xì)胞的凋亡，顯著抑制了胃癌裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)［6-8］。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種臨床治療胃癌常用的化療藥物，但因生物利用度低，對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性小、毒副作用大、治療劑量與中毒劑量接近等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用體外培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞株MCG803的方法，探討左金方和5-FU單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shella公司);DC300型倒置熒光相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司);超凈工作臺(tái)(比利時(shí)Esco公司);Rotofix32型離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);AllegraTM21R型低溫離心機(jī)(美國(guó)Coulter公司);Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó) Coulter公司); Polar star Galaxy型酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司)。

1.2 主要藥物與試劑

黃連、吳茱萸均購(gòu)自深圳華輝藥業(yè)有限公司，由深圳市中醫(yī)院中藥科劉志誠(chéng)主任藥師鑒定，分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖和蕓香科植物吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果實(shí)。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司; DMEM培養(yǎng)基、胰酶(trypsin，美國(guó)Gibico公司);胎牛血清(FBS，美國(guó) Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司)，5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào) 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美 國(guó)Lifetechnology公司)。

1.3 細(xì)胞

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人低分化胃腺癌細(xì)胞系MGC803購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物細(xì)胞中心(細(xì)胞源自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統(tǒng)湯劑凍干粉由本實(shí)驗(yàn)室提供，取黃連30 g、吳茱萸5 g加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min過(guò)濾，合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98 g。經(jīng)HPLC法測(cè)定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿0.17%，吳茱萸次堿0.19%。將左金方凍干粉溶于去離子水中配置成1 mg/mL的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

5-FU的配制方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1 mg/ml母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株、MGC803人胃腺癌細(xì)胞株在10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中，于37℃條件下，在濕度為100%、含CO2為5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 取人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(5×104/mL)加入96孔板、100 μL/孔，培養(yǎng)12 h后給藥，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的供試藥物，分別培養(yǎng)24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD)。其中將未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)定為100%。細(xì)胞抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)× 100%。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 調(diào)整人胃腺癌細(xì)胞MGC803密度為2×105/mL，以1.5 mL/well種入6孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，細(xì)胞刷刮取細(xì)胞，800 r/min離心5 min去上清，加入PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。取適量于流式管中，加入工作液500 uL，再加入熒光染料(10 uL Annexin V FITC和5uL PI混合液)，350目尼龍網(wǎng)濾膜過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，室溫避光染色15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI)。測(cè)定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的總和代表細(xì)胞調(diào)亡率。

2.3.3 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)

提取蛋白前將PMSF 10 μL加入1 mL細(xì)胞裂解液RIPA，取經(jīng)藥物作用后細(xì)胞約2.4×106個(gè)加入RIPA，冰上裂解30 min，10000 r/min離心10 min取上清。BCA測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。灌制12%分離膠，4%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。吸取80 μg總蛋白，恒壓100 V電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。濕法電轉(zhuǎn)恒壓100 V、120 min，將蛋白從SDSPAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。3%的脫脂奶粉/PBS-T封閉，按1∶500稀釋Rabbit anti-Bcl-2/-Bax，4℃孵育過(guò)夜。1∶3000稀釋二抗Goat anti-Rabbit IgG，孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)法(Enhanced Chemiluminescence，ECL)顯影，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 1010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.1.1 左金方對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，左金方對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響很小，即當(dāng)給藥濃度增加到一定程度后(如10 ug·mL－1)，隨著給藥濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力稍有減弱。圖1顯示，小劑量的左金方能促進(jìn)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和分裂，1.00 ug ·mL－1左金方作用GES-1細(xì)胞24、48 h的細(xì)胞存活率分別為(107.54±2.25)%和(115.96±2.86)%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.1.2 5-FU對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，5-FU對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)“濃度-時(shí)間依賴性”的關(guān)系，即隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸減弱，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。圖2顯示，小劑量的5-FU會(huì)對(duì)人正常胃黏膜細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，隨著用藥濃度增加其毒性亦增強(qiáng)。

圖1 不同濃度的左金方作用不同時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同濃度5-FU作用不同時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.2 藥物對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響

表1顯示，不同濃度左金方、5-FU作用于MGC803細(xì)胞24 h，腫瘤細(xì)胞中后期凋亡率隨給藥濃度的逐漸增高，給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，以中后期細(xì)胞凋亡更為明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.3 聯(lián)合用藥對(duì)GES-1和MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3.3.1 聯(lián)合用藥對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響 表2顯示，根據(jù)左金方與5-FU單獨(dú)用藥影響，GES-1和MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定1.00 ug·mL－1為左金方，50.00、100.00 ug·mL－1為5-FU聯(lián)合用藥的濃度。聯(lián)合用藥的CCK-8結(jié)果顯示，1.00 ug·mL－1左金方與50.00、100.00 ug·mL－15-FU聯(lián)合用藥，可大幅度降低5-FU對(duì)細(xì)胞的毒性，提高人正常胃黏膜細(xì)胞的存活率，聯(lián)合用藥的效果與5-FU單獨(dú)用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3.2 聯(lián)合用藥對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響 圖3、4顯示，從流式細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分別與50.00 ug·mL－1、100.00 ug·mL－15-FU聯(lián)合用藥作用于MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率大幅度提高(中后期凋亡占主導(dǎo))，聯(lián)合用藥組與左金方和5-FU單獨(dú)用藥比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)凋亡的作用優(yōu)于各單獨(dú)用藥組。

表1 不同濃度藥物作用24 h對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡率的影響(n=6)

表2 左金方與5-FU聯(lián)合用藥作用不同時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.4 左金方和5-FU單獨(dú)與聯(lián)合對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Western Blot凝膠電泳圖顯示，1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU分別作用于MGC803細(xì)胞24 h后，Bax的表達(dá)增加，而Bcl-2的表達(dá)減少;左金方聯(lián)合5-FU(1.00+ 50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00+100.00)用藥24 h后，Bax的表達(dá)進(jìn)一步增加，而Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步減少，與各單獨(dú)用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);圖5顯示，左金方和50.00 ug·mL－15-FU對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。

4 討論

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。早期胃癌多無(wú)癥狀或僅有輕微癥狀，當(dāng)臨床癥狀明顯時(shí)病變已屬晚期，所以胃癌切除術(shù)后化療已成為晚期胃癌的主要治療方法［9］。常用的化療藥物有絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)、氟脲嘧啶(5-FU)、足葉乙甙(VP-16)、阿霉素(ADM)、優(yōu)福定(UFT)等。化療藥物在胃癌的治療中有一定的效果，但其具有嚴(yán)重的毒副作用，會(huì)產(chǎn)生明顯的消化道反應(yīng)、骨髓抑制、身體虛弱、發(fā)熱、脫發(fā)、腎毒性、神經(jīng)毒性和過(guò)敏反應(yīng)等并發(fā)癥［10］。大量研究證實(shí)，中藥配合化療治療胃癌可明顯改變癥狀、增加有效率、延長(zhǎng)生存期，防復(fù)發(fā)、抗轉(zhuǎn)移，平衡和調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，提高和改善機(jī)體免疫能力，保護(hù)重要器官功能，減輕化療毒副反應(yīng)，提高生存質(zhì)量［11］。

圖3 各組Annexinⅴ/PI凋亡檢測(cè)圖

圖4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率

圖5 左金方和5-FU對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

本研究CCK-8結(jié)果顯示，左金方對(duì)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1活力影響很小，而小劑量的5-FU具有很明顯的細(xì)胞毒性。左金方與5-FU聯(lián)合用藥后，顯著提高人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，左金方與5-FU均能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC803的凋亡，二者聯(lián)合用藥后，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC803凋亡的作用優(yōu)于左金方或5-FU單獨(dú)用藥。

細(xì)胞凋亡是目前腫瘤研究中的熱點(diǎn)之一，目前普遍認(rèn)為凋亡與細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化類似，受細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控，是一個(gè)級(jí)聯(lián)式(cascade)基因表達(dá)的結(jié)果，bcl-2和bax的比率就成為細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵因素［12］和評(píng)價(jià)藥物抗腫瘤的重要指標(biāo)。大量的研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡是中藥治療腫瘤的重要機(jī)制。本研究中Western Blot凝膠電泳中Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，左金方與5-FU聯(lián)合用藥，促進(jìn)了MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)，其作用優(yōu)于單獨(dú)用藥。結(jié)合CCK-8和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，左金方與5-FU聯(lián)合用藥顯著提高人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細(xì)胞毒性作用，并通過(guò)促進(jìn)MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)，促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的凋亡。

臨床上依據(jù)腫瘤的組織分化(高分化、中分化和低分化)來(lái)判斷其惡性程度，高分化腫瘤惡性程度低、預(yù)后較好，低分化腫瘤惡性程度高、預(yù)后較差，中分化腫瘤介于二者之間。MGC-803細(xì)胞株屬于低分化胃腺癌細(xì)胞系，結(jié)合前期左金方誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901(中分化)的研究［6-8］，本研究不僅為左金方誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡作用增添了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為拓展可用于臨床治療胃癌的中藥及其復(fù)方制劑、降低抗胃癌化療藥物的毒副作用、提高治療效果提供了新的思路。

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Regulation of Growth and BAX/Bcl-2 Expression of Human Gastric Cancer Cells by Zuojin Decoction and 5-FU

ZHOU Hong-zu1，ZHOU Yu-lian2，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Guangdong Shenzhen 518020，China; 2.School of Medicine，Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518060，China)

Objective:to study the cell growth of Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1，the apoptosis of Human Gastric Carcinoma MGC803 and the changes of Bax/Bcl-2 in the level of protein expression caused by ZuoJinFang and 5-Fu separately and together.Methods:Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1 and Human Gastric Carcinoma MGC803 cells were cultured in vitro and treated by ZuoJinFang and 5-Fu with different concentration separately and together，the growth inhibitions of GES-1 cell were analyzed by Cell Counting Kit-8(CCK-8)，the apoptosis rates of MGC803 cell were studied by flow cytometry and the expressions of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.Results:After the cells treated by 1.00 ug·mL－1ZuoJinFang，50.00、100.00 ug·mL－15-FU for 24 h separately，the percentage of GES-1 cell viabilities were(107.54±2.25)%，(53.67±1.91)and(47.43±1.35)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)and(45.60±1.14)%;after the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the percentage of GES-1 cell viabilities were(81.66±2.22)%and(78.68±2.10)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(61.30± 1.71)and(71.30±1.79)%，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.The Western Blot gel electrophoresis figures show that the expressions of Bax were further increased and the expressions of Bcl-2 were decreased accordingly after the MGC803 cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00 +50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the GES-1 cells，promoted the apoptosis of gastric carcinoma MGC803 cells by promoting high expression of Bax protein and low expression of Bcl-2 protein.

ZuoJinFang;5-FU;GES-1;MGC803;Drug conbibation;Apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0777-04

2015-10-12

廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(20141253)

周紅祖(1971-)，女，新疆人，副主任藥師，從事中藥腫瘤藥理學(xué)及中藥學(xué)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥及其復(fù)方抗腫瘤的臨床與研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。