劉文娟，張　瓊，曹　霞

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院(昆明　650101)

腸道病毒EV71感染致中樞神經系統損傷機制及治療研究進展*

劉文娟，張瓊，曹霞△

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院(昆明650101)

【關鍵詞】腸道病毒71型；中樞神經系統損傷；發(fā)病機制

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)具有高度的嗜神經性，是兒童手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)和皰疹性咽峽炎的主要病原體之一，感染嚴重者可引起中樞神經系統損傷和神經源性肺水腫(neurogenic pulmonary edema，NPE)等病變，甚至危及生命[1]。研究[2]表明，近年來EV71在亞太地區(qū)流行呈上升趨勢，且在我國局部地區(qū)也發(fā)生過EV71大規(guī)模流行。目前，EV71已成為致嬰幼兒中樞系統病變的最主要病毒病原[3]。本文就EV71相關病原學、神經系統損傷、NPE發(fā)病機制及預后、病理變化及EV71疫苗研究進展作一綜述，為EV71相關研究提供理論依據。

1病原學

EV71是一種正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A型。世界上第一株EV71(BrCr株)于1969年從加利福尼亞一名HFMD患兒腦組織中分離出來[4]。中國科學院武漢病毒研究所于1995年從HFMD患兒糞便中分離出兩株EV71病毒[5]。EV71是HFMD及皰疹性咽峽炎的主要病原之一，可引起各類中樞神經系統損傷及致死性NPE，已引起國內外學者的廣泛關注。

EV71病毒顆粒是20面立體對稱球形結構，直徑約30 nm，無包膜和突起，由60個亞單位構成，每個亞單位由4種結構蛋白(VP1～VP4)組成。VP1～VP4包繞著由7 500個核苷酸構成的EV71基因組正鏈RNA，其中VP1、2、3暴露在病毒顆粒表面，而VP4則與病毒核心緊密連接。EV71顆粒表面沒有類脂膜，可抵御常見的消毒劑，但是對高溫(56 ℃， 30 min)、紫外線照射及各種強氧化劑敏感，能被快速滅活。EV71在體外可存活較久， 4 ℃能存活1年，-20 ℃可長期保存。

Brown等[6]于1999年首次將EV71劃分為A、B、C基因型，各基因型內部差異在6.0%～11.0%，兩型之間的差異在16.5%～19.7%，說明存在不同基因型的共存及基因變異。實驗研究[7]表明，2004年前我國流行的主要是C4b型，之后主要是C4a亞型。

人類是EV71唯一的傳染源，主要經胃腸道(糞-口、食物污染和水)或呼吸道(飛沫、咳嗽等)傳播，發(fā)病以嬰幼兒為主。在發(fā)病前數天，糞便及咽喉部即可發(fā)現病毒，此時即有傳染力，且一般在發(fā)病后一周內傳染力最強，潛伏期為2～10 d，平均3～5 d。

2EV71致中樞神經系統損傷

2.1無菌性腦膜炎

無菌性腦膜炎是除細菌或真菌以外的因素導致的腦膜炎癥?；純罕憩F為HFMD或皰疹性咽峽炎的同時，可伴有發(fā)熱、精神不佳、嗜睡和易激惹等癥狀。Chang等[8]對61例EV71感染伴無菌性腦膜炎患兒為期3年的隨訪發(fā)現，無菌性腦膜炎患兒均完全康復，無相關后遺癥。流行病學調查發(fā)現，EV71 感染后伴發(fā)無菌性腦膜炎，預后良好[9]。

2.2腦炎

腦炎是EV71直接感染腦組織引發(fā)的炎性病變，其臨床特點與病毒性腦炎相似，主要表現為意識障礙、行為異常和驚厥發(fā)作等，嬰幼兒多首先表現為發(fā)熱、驚厥等，預后相對良好。胡瓊文等[9]對32例EV71感染伴腦炎患兒3年隨訪后發(fā)現，只有1例患兒出現輕度面神經癱瘓，痊愈率高達96.8%。陳慶會[10]對81例腦炎患兒隨訪發(fā)現，僅有1例患兒出現左上肢遲緩性癱瘓，余患兒均治愈。

2.3腦干腦炎

腦干腦炎是EV71直接侵犯腦干引發(fā)的炎性病變，主要累及腦干背側及其相鄰的神經組織，主要表現為共濟失調、呼吸節(jié)律失調、流涎、嗆咳、眼球震顫、意識障礙、嘔吐、吞咽困難和心動過速等癥狀。根據臨床癥狀嚴重程度可分為3級，嚴重者病程進展迅速，可發(fā)生NPE、肺出血和循環(huán)衰竭，甚至危及生命，預后差。陳冉冉等[11]對82例EV71感染伴發(fā)腦干腦炎患兒3年的隨訪發(fā)現，14例(17%)患兒出現后遺癥，主要包括肢體無力、肢體抽搐、性格改變、睡眠呼吸障礙并吞咽障礙等。Huang等[12]對63例腦干腦炎患兒隨訪3年發(fā)現，9例存在后遺癥，主要包括運動協調障礙、小腦功能障礙和顱神經麻痹等，3例死亡。

2.4急性遲緩性麻痹(acute flaccida paralysis，AFP)

AFP是EV71感染致下運動神經元性癱瘓，臨床癥狀與脊髓灰質炎性麻痹類似，主要表現為急性雙側或單側肢體無力、肌力減低，腱反射減弱或消失。有研究[13]報道，EV71感染致AFP發(fā)病率為2%～8%，患者預后可分為完全恢復、遺留肢體無力或永久性肢體癱瘓，甚至死亡。彭炳蔚等[14]對16例AFP患兒行3個月的康復治療后，仍有11例(69%)存在肢體癱瘓。Liu等[15]報道，35例EV71感染患兒中有9例伴發(fā)AFP，1例放棄治療，1例死亡，7例經過治療后肢體肌力均有不同程度恢復。研究發(fā)現，EV71感染伴發(fā)AFP多為可逆性病變，經過積極治療可恢復，且單側下肢癱瘓較雙下肢或四肢癱瘓恢復較快。

2.5神經精神發(fā)育障礙

患兒神經精神發(fā)育障礙程度與臨床嚴重程度相關，主要表現為神經發(fā)育延遲、認知功能障礙、言語功能障礙和運動協調障礙等，嚴重者可同時存在多項功能障礙。Chang等[9]隨訪142例EV71感染患兒發(fā)現，43例伴發(fā)無菌性腦膜炎患兒神經發(fā)育均無明顯異常，但48例伴發(fā)嚴重CNS患兒則有22例出現不同程度的神經發(fā)育延遲，嚴重影響患兒的身心發(fā)育。CNS病變時可因基底核區(qū)、前額葉和小腦等功能異常導致患兒出現注意力缺陷多動障礙。Gau等[16]采用CTRS量表評估81例EV71感染伴CNS損傷患兒發(fā)現，該類患兒發(fā)生注意力缺陷多動障礙的比例明顯升高，并且多數患兒需要藥物控制。Tsou等[17]通過兒童運動評定成套試驗(MABC)評估107例EV71感染伴腦干腦炎患兒發(fā)現，95%的II期及IIIa患兒運動協調能力無明顯異常，但是IIIb患兒則存在明顯的粗細運功功能異常。另外，Chang等[9]對48例EV71感染伴腦干腦炎患兒進行WISC測試發(fā)現，38例>2歲患兒的言語理解分數為(104±12)分，而10例<2歲的則為(90±12)分， 提示EV71感染伴CNS損傷可能會影響患兒的言語理解能力，特別是對<2歲的患兒影響更明顯。

3EV71致CNS損傷發(fā)病機制

Lin等[18]通過對EV71感染死亡患兒進行尸檢發(fā)現，患兒CNS病變部位存在EV71及淋巴細胞，而李軍等[19]通過EV71感染小鼠模型也有類似發(fā)現，提示EV71可直接造成CNS損傷。EV71可能通過血液途徑、淋巴途徑、神經元通路直接累及CNS，也可能通過損傷機體的免疫系統進而加重患兒的病情[20]。

目前的研究[20]發(fā)現，在感染者的胃內容物、腸黏膜及糞便中均可分離出EV71病毒。Lin等[18]和郝博等[21]均通過尸檢在感染者尸體CNS中發(fā)現EV71及炎癥存在，同時通過病理檢查發(fā)現患兒腸系膜淋巴結明顯腫大，小腸及結腸的淋巴組織也明顯增生，故推測EV71可能通過淋巴液途徑上行累及CNS。研究結果還發(fā)現，EV71主要分布在星形膠質細胞中，而神經元中也有少量分布。Yip等[22]認為，EV71可能通過血液途徑累及CNS，感染CNS時存在病毒血癥期。但Chang等[9]發(fā)現，小鼠口服EV71可引發(fā)小鼠持續(xù)病毒血癥期，同時也增加小鼠血腦屏障的通透性，但小鼠腦組織的病毒量卻沒有明顯增加，這提示血源性途徑可能并非是EV71累及CNS的主要途徑，且目前也沒有在EV71感染患者血液中分離出EV71顆粒的報道。

EV71的高度嗜神經特性與病毒顆粒表面的衣殼蛋白有關，故有學者推測EV71侵入機體后可能通過逆向軸突運輸途徑累及CNS[23-24]。Wong等[24]在患者的神經元及軸突上發(fā)現EV71抗原的存在，進一步證實EV71可直接累及神經元或軸突。Chen等[25]通過動物實驗也證實神經通路的逆行軸突運輸可能是EV71累及CNS的主要方式。EV71感染神經細胞后還可通過激活凋亡途徑誘導神經細胞凋亡進而損傷腦組織，甚至是遺留后遺癥。

EV71多感染嬰幼兒，而嬰幼兒的免疫系統并不成熟，進一步增強了EV71對嬰幼兒感染的易感性。EV71感染伴腦干腦炎患兒外周血中CD4+、CD8+T細胞均明顯降低，提示EV71感染可損害機體的細胞免疫功能。而免疫功能下降，機體清除體內病毒的能力也降低，導致病情加重。Shih等[26]研究認為，EV71感染伴CNS損傷與補體的激活有關， EV71感染神經細胞后，補體C3a、C4a等明顯升高，也可同時通過旁路激活途徑激活C5a進而刺激巨噬細胞分泌趨化因子誘導大量多核中性粒細胞聚集活化，最終導致組織損傷。因此，深入研究細胞免疫和補體激活在EV71感染伴CNS損傷中的作用，有益于EV71發(fā)病機制的探索。

Ho等[27]認為，細胞微環(huán)境會影響宿主細胞對EV71的易感性，而氧化應激是重要因素之一；氧化環(huán)境中，EV71復制更活躍，但在抗氧化劑的干預下，EV71的復制能力則受到明顯限制，故推測EV71對機體的易感性與宿主微環(huán)境的氧化還原狀態(tài)有關。另有研究[28]報道，EV71可能與神經細胞表面清道夫受體B2直接結合，介導EV71累及神經細胞，故推測清道夫受體B2在EV71感染中發(fā)揮重要作用。

4EV71感染的治療

臨床上尚沒有治療EV71的特異性藥物，主要以對癥支持治療為主，目前關于抗EV71藥物的研究主要包括病毒衣殼結合制劑、蛋白酶抑制劑、RNA多聚酶抑制劑、免疫球蛋白及單克隆抗體治療等。

4.1病毒衣殼結合制劑

EV71病毒衣殼是由4種衣殼蛋白(VP1～VP4)組成的五聚體樣結構。咪唑啉酮衍生物BPROZ-194可通過與EV71病毒顆粒衣殼蛋白VP1結合而阻礙病毒對宿主細胞的吸附和脫殼，進而發(fā)揮抗病毒效應[29]。體外實驗表明，該藥物能抑制EV71感染導致的細胞病變效應，且細胞毒性很低；當衣殼蛋白VP1第192位的纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼釙r，EV71可對該類藥物發(fā)生耐藥性[30]。

4.2蛋白酶抑制劑

3C蛋白酶是EV71病毒復制所必須的一種特異性蛋白酶，基因組學研究[31]發(fā)現，編碼3C蛋白酶的基因序列呈高度保守，故通過抑制3C蛋白酶可能成為治療EV71的重要靶點。蘆平曲韋是針對3C蛋白酶研發(fā)的藥物之一，也是最有可能成為有效的抗EV71藥物之一[10]。體外實驗顯示，蘆平曲韋具有抗EV71作用(EC50=1.55 μmol/L)[32]。Kuo等[33]研發(fā)的化合物10b是在蘆平曲韋的基礎上合成的3C蛋白酶抑制劑，且體外實驗表明10b具有顯著的抗EV71效應，但其是否能在體內發(fā)揮抗EV71效應有待進一步的動物研究。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)對泛素蛋白酶體系統(UPS)具有抑制效應。有研究[34]報道，PDTC可通過抑制EV71感染細胞的UPS發(fā)揮抗EV71作用。Shang等[35]發(fā)現，AG7088是一種蛋白酶抑制劑，具有協同抗EV71作用，可聯合其他抗病毒藥物治療EV71。

4.3RNA多聚酶抑制劑

金黃三羧酸是一類具有抑制RNA多聚酶的陰聚離子復合物，可通過影響病毒的復制達到抗病毒的作用。有學者通過體外實驗發(fā)現，可通過抑制EV71病毒的RNA多聚酶發(fā)揮抗EV71效用(EC50=2.9 μmol/L)，且對宿主細胞的影響較小[36]。Velu等[37]發(fā)現，BPR-3P0128是一種羧酸類化合物，也可通過抑制EV71的RNA多聚酶，在病毒感染早期明顯抑制EV71復制，具有明顯的抗病毒效應。

4.4免疫球蛋白治療

經靜脈免疫球蛋白(IVIg)注射對免疫缺陷或免疫低下的患者具有積極的增強免疫或抗感染的作用，主要應用于自身免疫性疾病如ITP或川崎病等，而免疫球蛋白IgGs抗EV71的效用也是目前的研究熱點。Wang等[38]發(fā)現,免疫球蛋白可通過調節(jié)EV71感染者的炎癥因子從而快速改善患者的全身癥狀，特別是對于免疫低下患者，具有明顯的抗EV71效應。研究[39]還發(fā)現，免疫球蛋白內的中和抗體亦具有一定程度的抗EV71作用。目前免疫球蛋白主要從健康人群血清中獲取，不同的人群或不同的獲取方式都會影響該療法的抗EV71作用及穩(wěn)定性。因此對于IgGs應用于抗EV71的機制及方案仍有待進一步研究及完善。

4.5單克隆抗體治療

單克隆抗體療法與IVIg療法類似，也是當前熱門的免疫學治療方法。單克隆抗體可根據病毒表面抗原或變異病毒抗原進行制定，進而可以特異性地對抗把抗原病毒。有研究[40]報道，可通過單克隆抗體治療EV71，對于存在多個亞型抗原的病毒，可以同時制定多個特異性抗體進行治療。目前已研發(fā)出可以針對11種病毒抗原亞型的單克隆抗體，如Mab51、10D3等，該類抗體均屬于IgM[41]。其中Mab51主要是針對EV71衣殼上VP1蛋白的KEQK氨基酸序列位點，而10D3則主要是中和VP3上高度保守的“knob”區(qū)域。小鼠體內實驗均證實Mab51、10D3具有顯著的抗EV71作用[42]。因此，眾多學者認為單克隆抗體對于治療EV71具有重要的應用前景。

5EV71疫苗研究進展

疫苗是預防傳染性病毒感染最安全有效的方式，常見的疫苗載體有失活疫苗、減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、DNA疫苗和重組亞單位疫苗等。目前雖然對EV71疫苗的研究已取得一定成果，但仍沒有針對性的疫苗面世。減毒活疫苗對中樞系統有輕微影響，且疫苗可能有毒力恢復的風險，限制了減毒活疫苗的應用，故有待進一步研究改善其安全性[41]。DNA疫苗的研究尚處于起步階段，旨在將病毒相關免疫蛋白的基因片段轉入質粒載體而構建疫苗，接種后通過機體內表達相關抗原從而引起體液及細胞免疫[42]。Mat-Rahim等[43]針對EV71-VP1蛋白基因序列制作DNA疫苗，接種小鼠后能誘導產生更高滴度的抗體。另有研究[44]報道，DNA疫苗可一定程度上增強機體的體液及細胞免疫，具有一定抗EV71作用，但效果較失活疫苗差，這可能與DNA疫苗在機體內表達水平及病毒變異有關。且DNA疫苗作為外源性核酸物質是否會影響機體的遺傳表觀尚不確定，故對于DNA疫苗的研發(fā)應用仍將面臨眾多問題[44]。重組亞單位疫苗是將EV71病毒衣殼蛋白VP1作為免疫靶點，小鼠體內實驗顯示，重組亞單位疫苗具有一定的抗EV71效果，但因E不同亞型V71病毒VP1蛋白抗原性差異較大，故重組亞單位疫苗的交叉保護能力有限。失活疫苗和病毒樣顆粒疫苗是目前制作及應用相對成熟的免疫方式，加強研發(fā)這兩類疫苗仍是目前的主流。

5.1失活疫苗

失活疫苗是一種保留病原體免疫抗原性的疫苗，其安全性高，但需多次免疫。Zhu等[45]研發(fā)的首個EV71滅火疫苗經過III期臨床試驗結果表明，該疫苗對EV71感染導致的HFMD預防率達90%，具有高度的免疫原性及安全性。獼猴體內實驗表明，接種3次EV71失活疫苗后，體內的抗體效價達到高峰，且其中和抗體滴度一直保持100%，直到實驗結束[46]。Wu等[44]研究顯示，失活EV71疫苗接種后的小鼠對EV71具有顯著抗性，且失活疫苗的保護性明顯高于DNA疫苗及重組亞單位疫苗。綜合目前的研究成果，深入研究EV71滅火疫苗具有廣泛的應用前景。但失活疫苗也存在一定的缺點，如因EV71存在較高的基因變異，制備同時具有廣譜抗原性的疫苗將是該疫苗研發(fā)所面臨的巨大挑戰(zhàn)，同時失活疫苗主要是誘導體液免疫，對于細胞免疫誘導不足等也會制約該類疫苗的應用[45,47]。因此進一步完善失活疫苗，或研發(fā)其他免疫形式的疫苗也是必要的。

5.2病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒疫苗(virus-like particle， VLP)是由EV71病毒的衣殼蛋白構成的，不含有病毒的核酸成分，但保留了病毒的表面抗原性，進而可以誘導體液和細胞免疫，不存在致病風險且安全性高，是一種具有良好應用前景的疫苗形式。當前已有多種成熟的VLP疫苗應用于臨床，如人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、登革熱病毒和流感病毒等[48]。Chung等[49]通過動物實驗表明，EV71 VLP疫苗可誘導小鼠持續(xù)產生高滴度中和抗體，同時還可誘導細胞免疫應答，產生IL-4和IL-2等抗炎因子，增強抗EV71作用；研究還發(fā)現，與失活疫苗相比，VLP疫苗抗EV71效應更好，但受提純方式限制，不易獲得高純度的VLP疫苗，目前新加坡有學者正在進行VLP提純方法的研究。另有報道[50]顯示，EV71 VLP疫苗免疫的母鼠可將抗EV71抗體傳遞給乳鼠，90%以上的乳鼠可在受到致死劑量EV71感染時獲得保護，而對照組乳鼠則全部死亡。綜合當前研究結果，VLP疫苗具有高免疫原性及安全性的優(yōu)點，但疫苗的純化方式仍有待進一步改善。

EV71感染是目前威脅嬰幼兒健康的最為嚴重的病原體之一，今后的研究仍需重點關注以下幾個方面：1)建立科學完善的EV71流行監(jiān)測系統，以防EV71大規(guī)模流行；2)建立EV71的快速診斷措施，以及時確診可疑患者，為患者的早期治療爭取最佳時機；3)建立科學的動物模型，加強研究有效的抗EV71藥物或預防性疫苗；4)通過動物模型或分子研究探索EV71與宿主相互作用的途徑及機制，進而為抗EV71藥物及疫苗的研發(fā)提供理論依據。

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doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.030

*基金項目:國家自然科學基金(No:31160206)

通信作者：△曹霞，E-mail：363768712@qq.com

【中圖分類號】R725.1

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160221.2012.022.html

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