肖忠華,黃海兵 綜述，郝 坡 審校

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系/重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心 404120)

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·綜 述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.043

側(cè)流免疫法在臨床即時(shí)檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展

肖忠華,黃海兵 綜述，郝 坡△審校

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系/重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心 404120)

側(cè)流免疫法；即時(shí)檢驗(yàn)；信號探針；多組分檢測

即時(shí)檢驗(yàn)(point of care testing,POCT)是當(dāng)今臨床檢驗(yàn)發(fā)展的趨勢之一。側(cè)流免疫法，最早被稱為“溶膠粒子免疫法”，它是以含有被粒子標(biāo)記的待測抗原(抗體)或被粒子標(biāo)記的免疫復(fù)合物[待測抗原(抗體)]與被粒子標(biāo)記的抗體(抗原)生成的免疫復(fù)合物]的液體樣品或提取溶液為流動相，以固定有檢測線和控制線的條狀聚合物層析材料為固定相，流動相通過毛細(xì)作用在固定相中向前移動的過程中，流動相中所含被粒子標(biāo)記的待測抗原(抗體)或免疫復(fù)合物與被固定在檢測線上的抗體(抗原)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被捕獲，形成檢測線；而流動相中未被捕獲的游離的以粒子標(biāo)記的待測抗原(抗體)或免疫復(fù)合物則與被固定在控制線上的抗體(抗原)或抗-IgG發(fā)生免疫反應(yīng)，形成控制線；之后，通過測量并比較檢測線和控制線上標(biāo)記粒子的光、電、磁、電化學(xué)等信號強(qiáng)弱來定性、半定量和定量測定待測抗原或抗體的方法，又稱為免疫層析法[1]。由于側(cè)流免疫法簡便、快速，在病毒、病原微生物、寄生蟲、糖、脂、蛋白質(zhì)、核酸等臨床檢驗(yàn)對象的POCT中獲得了廣泛的應(yīng)用。近年來，隨著納米材料的興起，一批生物相容性好并具有良好電、光、磁、電化學(xué)等性質(zhì)的納米粒子被發(fā)展為高靈敏度的光信號、磁信號、電化學(xué)信號探針，這些高靈敏度探針和信號探針的便攜式檢測設(shè)備(如適配手機(jī)的便攜檢測裝置)，以及信號探針檢測手機(jī)應(yīng)用程序等的應(yīng)用，使得側(cè)流免疫法在高靈敏度和定量方面取得了長足的進(jìn)步。本文簡要?dú)w納總結(jié)側(cè)流免疫法在臨床POCT應(yīng)用研究中可視化、熒光等高靈敏度探針和多組分檢測的進(jìn)展。

1 高靈敏度信號探針

1.1 可視化探針 納米金、膠乳微粒是最常見的可視化探針[1]，可視化探針與圖像處理設(shè)備聯(lián)用可提高靈敏度和實(shí)現(xiàn)定量檢測。近年膠乳微粒作為可視化探針研究報(bào)道較少，而采用多種方法對納米金可視化探針信號放大以降低檢出限較多。Zhu等[2]以13 nm金納米標(biāo)記肌鈣蛋白檢測抗體(同時(shí)將標(biāo)記有生物素的單鏈DNA標(biāo)記在金納米上)作為信號探針固定在第二連接區(qū)，以標(biāo)記上親和素的41 nm金納米固定在第一連接區(qū)，檢測線固定肌鈣蛋白捕獲抗體，由于利用了生物素-親和素連接的較大顆粒金納米作為信號放大，使得雙抗夾心側(cè)流免疫法測定肌鈣蛋白檢測限低至1 ng/mL。Jue等[3]以聚乙二醇2000包覆膠體金為探針側(cè)流免疫法測定從大腸埃希菌培養(yǎng)液標(biāo)本中提取的高鹽基質(zhì)中的模式病毒噬菌體M13，減少了高鹽基質(zhì)造成膠體金吸附的抗體的脫附影響，其檢測限比不用聚乙二醇處理提高了10倍。Yang等[4]以聚丙烯酸包覆核殼結(jié)構(gòu)的四氧化三鐵/金納米負(fù)載梅毒螺旋體抗原側(cè)流免疫法檢驗(yàn)梅毒螺旋體抗體含量，由于采用核殼結(jié)構(gòu)使得單位面積負(fù)載的金納米增多，負(fù)載的抗原增多，同時(shí)采用聚丙烯酸包覆在整個(gè)金納米殼外層也增加了探針的單分散性和穩(wěn)定性，抑制了探針的聚集，其檢測限低至1 U/mL。Xu等[5]采用金納米包覆的硅納米棒作為探針，由于硅納米棒表面積大，負(fù)載納米金多，連接的抗體多，大大提高了納米金復(fù)合探針的靈敏度，其檢測限低至0.01 ng/mL。可見，通過增加負(fù)載金納米材料的表面積和通過帶負(fù)電荷的聚合物處理抑制納米金的聚集可以提高納米金探針可視化檢測的檢測限，而最常采用的銀增強(qiáng)的納米金探針信號放大技術(shù)，因需額外加入銀離子增加反應(yīng)程序和延長反應(yīng)時(shí)間而較少應(yīng)用。無定型碳納米的生物分子相容性好，Linares等[6]以生物素親和素為模型分析物系統(tǒng)比較了無定型納米碳黑100、銀增強(qiáng)金納米、金納米、藍(lán)色膠乳顆粒的靈敏度，它們的檢測限按上述順序依次增加，無定型納米碳黑100檢測限最低，表明無定型碳納米作為可視化探針的誘人前景[7]。

1.2 熒光探針 有機(jī)染料熒光微球是目前最為常用的一類熒光探針，而當(dāng)前的研究熱點(diǎn)則是量子點(diǎn)探針、鑭系螯合物摻雜無機(jī)熒光探針和鑭系摻雜無機(jī)上轉(zhuǎn)換發(fā)光熒光探針。

鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料是具有低能量激發(fā)(近紅外)和高能量發(fā)射(紫外-近紅外)的反斯托克位移材料，化學(xué)穩(wěn)定性高、熒光量子產(chǎn)率高、低毒性、無背景熒光干擾，作為熒光探針可獲得很高的信噪比，而且，其近紅外的激發(fā)光能不為生物組織所吸收，不會破壞生物樣本，因此，在臨床生物檢驗(yàn)和診療中獲得廣泛應(yīng)用[8]。Van Dam等[9]系統(tǒng)評估鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光熒光探針側(cè)流免疫法與酶聯(lián)免疫法測定血吸蟲陽極抗原的診斷性能：低濃度區(qū)域上轉(zhuǎn)換發(fā)光熒光探針側(cè)流免疫法更靈敏，檢測限低至30 pg，變異系數(shù)更小，而且其檢驗(yàn)結(jié)果18個(gè)月前后兩次測定保持一致，這表明上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針側(cè)流免疫法有很強(qiáng)的耐受性。

稀土螯合物摻雜的熒光物質(zhì)Stoke位移長、發(fā)射譜帶窄、熒光強(qiáng)度高，是熒光微球研究者關(guān)注的焦點(diǎn)領(lǐng)域之一。銪螯合物摻雜的熒光微球是鑭系稀土螯合物摻雜熒光微球最有前途的種類之一。Juntunen等[10]比較了銪螯合物摻雜聚苯乙烯熒光微球和膠體金作為側(cè)流免疫探針測定生物素-BSA和PSA的檢測限，分別提高了300倍和7倍。Xia等[11]將銪螯合物包被在硅納米球表面作為探針，由于表面積更大的硅球結(jié)合的銪螯合物摻雜的熒光分子增多，產(chǎn)生了更大的斯托克位移，能發(fā)射更容易分辨的615 nm長波光譜，以該探針測定乙型肝炎表面抗原的檢測限低至0.03 μg/mL，比以膠體金作為探針的檢測限降低了100倍。新近上市的商品化銪螯合物摻雜熒光微球?yàn)闊晒馓结樀纳逞垡略w側(cè)流免疫試劑盒在臨床大樣本系統(tǒng)評估中檢測限也達(dá)到了0.27 ng/mL[12]。量子點(diǎn)具有較寬激發(fā)光譜、較窄發(fā)射光譜、高量子產(chǎn)率、發(fā)光穩(wěn)定、幾乎無光褪色現(xiàn)象，而且生物相容性好，可同時(shí)連接幾個(gè)生物分子，是較好的熒光探針[8]。由于量子點(diǎn)粒徑較小，需要在制備過程中加入巰基丙酸、巰基乙胺等穩(wěn)定劑，防止其團(tuán)聚而淬滅，依其穩(wěn)定劑的種類可分為水溶性量子點(diǎn)和油溶性量子點(diǎn)。水溶性量子點(diǎn)可直接作為熒光探針[13]，也可以加入試劑使得納米金被還原的同時(shí)量子點(diǎn)熒猝滅等[14]間接方法作為熒光探針。采用表面積和粒徑更大的硅納米、磁性納米等負(fù)載更多粒徑小的量子點(diǎn)是提高量子點(diǎn)熒光探針靈敏度的常用手段[15]。對于油溶性量子點(diǎn)，研究者則嘗試共價(jià)連接極性有機(jī)分子或以相轉(zhuǎn)移、微乳液等方法包被納米硅或聚合物來改善其水溶性，提高其在側(cè)流層析相轉(zhuǎn)移過程中的化學(xué)穩(wěn)定性和膠態(tài)穩(wěn)定性。Li等[16]采用兩性分子丙烯酸叔丁酯-丙烯酸乙酯-丙烯酸甲酯共聚物自組裝包被量子點(diǎn)納米珠側(cè)流免疫法檢測PSA，檢測限低至0.33 ng/mL。Zhou等[17]以微乳液法制備聚苯乙烯量子點(diǎn)(紅、綠、藍(lán)三種顏色)復(fù)合納米球作為探針，側(cè)流免疫法測定AFP，不僅檢測限可低至0.1 ng/mL,而且可耐受更高的溫度、更高鹽濃度、更極端pH。盡管如此，與鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料相比較，量子點(diǎn)的毒性和高能激發(fā)下的自發(fā)熒光則是其不足之處。

1.3 散射探針 納米金屬或以聚合物或硅包封的納米金屬可為散射探針，其中,納米金和納米銀最為常用[18]。You等[19]以3D打印技術(shù)設(shè)計(jì)打印可安裝在手機(jī)上的適配裝置使得試紙條與手機(jī)相機(jī)(CCD或CMOS)發(fā)出的入射光呈65°夾角(此時(shí)檢測器與入射光呈110°夾角)來最小化硝酸纖維素膜的米氏散射，從而最大化納米金探針的瑞利散射，結(jié)合自主開發(fā)的手機(jī)應(yīng)用，側(cè)流免疫法測定TSH的檢測限可低至0.31 mIU/mL。Noble等[20]以巰基化玻璃包封金納米的核殼復(fù)合納米(金為核，玻璃為殼)作為表面增強(qiáng)拉曼探針，側(cè)流免疫法檢驗(yàn)cTnI的檢測限低至38 pmol，與熒光探針側(cè)流免疫法檢測限相當(dāng)。這些研究結(jié)果表明納米金屬作為散射探針比作為可視化探針靈敏度更高，并可采用可視化和散射兩種檢測模式來定性定量。同時(shí)啟發(fā)研究者可探索其他具有光散射特性的納米金屬粒子作為瑞利散射、表面增強(qiáng)拉曼、共振散射探針。

1.4 磁性探針 磁性材料不僅可作為改善其他核殼型粒子探針分析性能的磁核和磁性分離載體，還可直接作為磁性探針。其作為磁性探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：磁性可完全被磁性記錄儀捕獲，樣本中磁性物質(zhì)少而引起的干擾少，因而可提高側(cè)流免疫靈敏度，并且磁性數(shù)月內(nèi)很穩(wěn)定，耐受性好[21]。Workman等[22]以順磁性磁珠作為磁性探針標(biāo)記HIV p24抗原的抗體，側(cè)流免疫法捕獲HIV p24抗原，檢測限低至30 pg/mL。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)順磁性探針標(biāo)記的抗體與大于1 μm粒徑待測物的復(fù)合物在層析中沉積在某個(gè)特定位置，可通過直接測定沉積線處磁性進(jìn)行定量，揭示了一種大粒徑待測物的磁性探針新方法。

1.5 近紅外有機(jī)小分子探針 由于有機(jī)小分子熒光染料的激發(fā)/發(fā)射波長通常在300～600 nm，往往與其自發(fā)熒光以及常見標(biāo)本全血、血漿、血清和硝酸纖維素膜吸收譜重疊，帶來很高的信噪比，因此，有機(jī)小分子熒光染料在側(cè)流免疫法中較少應(yīng)用。但是有機(jī)小分子染料作為信號探針也有其獨(dú)特的優(yōu)勢，小分子鏈接生物大分子不會發(fā)生聚集，共價(jià)連接更快速、容易、可控、可定量；可采用更小孔徑的纖維素膜，側(cè)流速度更慢，從而可改善側(cè)流免疫法的分析性能。Swanson等[24]采用激發(fā)/發(fā)射波長在近紅外區(qū)的800 CW有機(jī)小分子染料(780 nm/800 nm)為近紅外信號探針，側(cè)流免疫法測定IL的線性范圍為0～200 pg/mL，揭示出近紅外有機(jī)小分子染料側(cè)流免疫法的優(yōu)異分析性能和應(yīng)用前景。

1.6 化學(xué)發(fā)光探針 化學(xué)發(fā)光常用的天然酶貯存條件苛刻，酶活性長期保存中易下降，通常需額外程序加入反應(yīng)底物等試劑來實(shí)現(xiàn)測定[25]，這使得化學(xué)發(fā)光探針在側(cè)流免疫法中的應(yīng)用受到限制。由于鉑納米熱穩(wěn)定性高，易于長期保存，又具有過氧化物酶活性，是良好的人工模擬酶，Park等[26]將鉑納米作為探針標(biāo)記抗體，夾心免疫側(cè)流法測定hCG,檢測限比膠體金下降了1 000倍，達(dá)到1 mIU/L。Joung等[27]以乙酰膽堿酯酶標(biāo)記抗體作為捕獲抗體固定于測試線上，將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體固定于連接區(qū)和測試線之間，將魯米諾、化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑和乙酰膽堿固定在連接區(qū)，在連接區(qū)與硝酸纖維素膜之間放置不對稱聚砜膜，隨著樣品中C反應(yīng)蛋白(CRP)的層析，CRP先后與檢測抗體和捕獲抗體反應(yīng)，連接區(qū)的底物等由于不對稱聚砜膜的延遲釋放，最后到達(dá)測試線和控制線處，通過乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿原位產(chǎn)生過氧化氫，在增強(qiáng)劑催化下與魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，CRP檢測限低至1 ng/mL，由于雙酶標(biāo)記和不對稱膜的延遲釋放使得化學(xué)發(fā)光側(cè)流免疫法可一步完成。這些研究為側(cè)流免疫中高靈敏度的化學(xué)發(fā)光探針的長期貯存和自動化方面作出了有益的探索。

1.7 電化學(xué)探針 電化學(xué)法靈敏度高，背景低，易定量，易微型化，研究者不斷嘗試直接或?qū)㈦娀钚晕镔|(zhì)通過脂質(zhì)體等包封作為電化學(xué)探針，并用納米材料和酶標(biāo)記等手段來增強(qiáng)電化學(xué)探針的靈敏度[28]。Du等[29]設(shè)計(jì)一個(gè)微型裝置，該裝置將切斷試紙條測試區(qū)、試紙條置放反應(yīng)區(qū)、微型電化學(xué)測定整合在一起實(shí)現(xiàn)血標(biāo)本中乙酰膽堿酯酶活性的測定，檢測限可低至0.02 nmol。Zhu等[30]將碳納米管紙電極(傳感面朝向硝酸纖維素膜)固定在競爭免疫法膠體金試紙條對照區(qū)作為工作電極，在以膠體金可視化檢測的同時(shí)，以計(jì)時(shí)電流法測定8-羥基脫氧鳥苷，檢測限可低至2.07 ng/mL，消除了與DNA片段相連的8-羥基脫氧鳥苷猝滅膠體金而使得可視化檢測結(jié)果偏低。然而生物體液標(biāo)本中如抗壞血酸、堿性磷酸酶等使電化學(xué)探針應(yīng)用帶來一定使用，Akanda等[31]以摻雜氧化銦電極為工作電極，以β-Gal、4-氨基-1-萘酚、三價(jià)六氨基釕、三(3-羰基乙基)膦之間發(fā)生快速的電化學(xué)-化學(xué)-化學(xué)氧化還原循環(huán)反應(yīng)，側(cè)流免疫法檢測cTnI的檢測限達(dá)到0.1 pg/mL，由于循環(huán)伏安掃描電壓僅用到0.05 V，在避免了血清中堿性磷酸酶的干擾之外，還最小化了血清中電氧化性物質(zhì)的干擾。然而，由于溶液在不同界面滲透強(qiáng)度不一致，可能導(dǎo)致電化學(xué)探針信號不穩(wěn)定的研究較少[28]，應(yīng)引起重視。

2 多組分檢測

在單個(gè)分析流程中同時(shí)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)及以上組分檢測，可減少樣品消耗，節(jié)約時(shí)間成本，提高分析通量，降低整個(gè)分析的成本?？臻g分辨是側(cè)流免疫法多組分同時(shí)檢測的主要模式。采用同種探針標(biāo)記兩種待測物、兩條檢測線來實(shí)現(xiàn)兩組分同時(shí)檢測的可視化[2]、鑭系摻雜熒光微球[32]、鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光[33]、近紅外[24]等空間分辨?zhèn)攘髅庖叻ㄒ延袌?bào)道。采用同類不同種探針標(biāo)記兩種待測物、同一條檢測線來實(shí)現(xiàn)兩組分同時(shí)檢測的鑭系摻雜熒光微球[32]、量子點(diǎn)熒光[13]、表面增強(qiáng)拉曼散射[20]等光譜分辨模式的側(cè)流免疫法也有少量應(yīng)用。雖然同時(shí)結(jié)合空間分辨和光譜分辨可能在同一條單條試紙條上實(shí)現(xiàn)兩種以上組分的檢驗(yàn)[32]，然而采用共用樣品區(qū)而檢測區(qū)、對照區(qū)等可根據(jù)檢測需要設(shè)計(jì)成二維多通道等的策略來實(shí)現(xiàn)空間分辨更有優(yōu)勢[34-35]。

3 展 望

近年來，隨著具有良好光、電、磁性質(zhì)的納米粒子的涌現(xiàn)，研究者不斷探索可視化、熒光、散射等光學(xué)探針[36]、磁性探針、化學(xué)發(fā)光探針、電化學(xué)探針和有機(jī)小分子染料近紅外探針等為基礎(chǔ)的高靈敏度側(cè)流免疫法和多組分側(cè)流免疫法及兩種不同機(jī)制聯(lián)用[19,30]的側(cè)流免疫法，使得臨床檢驗(yàn)中的側(cè)流免疫法朝著高靈敏度、多組分、簡便、快速和耐受方面快速發(fā)展，表明了側(cè)流免疫法在POCT和“4P”醫(yī)療模式中具有廣泛的應(yīng)用前景。為更好地適應(yīng)POCT的實(shí)際運(yùn)用，化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)探針中天然酶的替代，各種探針中抗體的替代，多組分檢測中探針的交叉干擾，探針的特異性及更高靈敏度探針的開發(fā)，便攜式探針檢測設(shè)備的進(jìn)一步微型化和智能化，尤其是智能手機(jī)探針檢測軟件的開發(fā)和結(jié)合3D打印技術(shù)的探針適配設(shè)備的微型化、標(biāo)準(zhǔn)化[19,25,37]及其與醫(yī)院、患者診療數(shù)據(jù)等連接分析等[37-38]都將是未來的發(fā)展方向和研究重點(diǎn)。

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重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(KJ131804)。 作者簡介：肖忠華(1974-)，副教授，碩士，主要從事生物分析化學(xué)教學(xué)與研究。△

R446.1

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1671-8348(2016)28-4008-04

2016-06-07

2016-07-15)