●史妍婷 丁福榮 陳芳 程海清 劉永

參苓白術(shù)散含藥血清影響A549/DDP的順鉑耐藥的研究

●史妍婷 丁福榮 陳芳 程海清 劉永

目的：研究參苓白術(shù)散含藥血清對肺腺癌順鉑細胞株(A549/DDP)順鉑耐藥的影響。方法：動物隨機分組，制備參苓白術(shù)散大中小劑量血清(給藥劑量分別為11.34，5.67，2.83g·kg-1·d-1)，將A549,A549/DDP細胞體外分為順鉑(DDP)組，空白血清+DDP組，含藥血清大劑量+DDP組，含藥血清中劑量+DDP組，含藥血清小劑量+DDP組，細胞對照組，經(jīng)過15%各組血清聯(lián)合DDP不同濃度(10，20，40，80，100，200 μmol·L-1)作用48 h,采用MTT法檢測參苓白術(shù)散不同濃度含藥血清對A549/DDP順鉑耐藥的作用；結(jié)果:與DDP組比較,參苓白術(shù)散不同濃度含藥血清作用于A549/DDP后IC50和耐藥倍數(shù)均有顯著降低(P＜0.05)，以中劑量組(等臨床劑量組)作用最為顯著(P＜0．01)。結(jié)論:參苓白術(shù)散能增強A549/DDP對順鉑的敏感性。

參苓白術(shù)散；腫瘤；A549/DDP

肺癌的發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤的首位，對中晚期肺癌實施的以順鉑為主的聯(lián)合化療方案可顯著延長患者的生存期。但由于順鉑耐藥的發(fā)生，中晚期非小細胞肺癌經(jīng)驗性化療療效長期停滯于平臺期[1，3]。因此尋找有效逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的藥物是成功干預肺癌化療的關(guān)鍵。前期研究成果表明，參苓白術(shù)散可通過提高患者的免疫能力，抗癌，消炎，保護受累組織等方面對中晚期肺癌起到綜合性正性治療作用[2]。為深入探討其分子作用機制，我們運用血清藥理學實驗方法，體外研究參苓白術(shù)散對人肺腺癌細胞株(A549)順鉑耐藥細胞系(A549/DDP)的影響.

1 材料

1.1 藥品和試劑

參苓白術(shù)散藥材購于濟南協(xié)和大藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規(guī)定，將參苓白術(shù)散生藥飲片濃縮成每毫升相當于原生藥材1.134g的藥液，冷卻后裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱保存。順鉑(DDP)(齊魯制藥廠,批號WA1A1104003),DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone，批號SH30022.01),胎牛血清(Hyclone，批號SV30087.02),MTT鹽溶液(Genview,批號DH343-3)

1.2 動物

SD大鼠16只，許可證號SCXK（魯）2015-0001，雌雄各半，體重(190-230)g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.3 細胞株

A549/DDP,A549細胞株均購于中國醫(yī)學院腫瘤研究中心，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37℃，5%C02條件下培養(yǎng)。

1.4 儀器設備

EL340i酶標儀(美國伯樂)，CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus)，TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡)，Thermo CO2培養(yǎng)箱(美國)，

2 方法

2.1 含藥血清的制備

動物按體重隨機分為4組，A組為參苓白術(shù)散含藥血清大劑量組(給藥劑量11.34g·kg-1)，B組為參苓白術(shù)散含藥血清中劑量組(給藥劑量5.67g·kg-1，相當于臨床等效劑量)，C組為參苓白術(shù)散含藥血清小劑量組(給藥劑量2.83g·kg-1)，D組為空白對照組(灌服相應體積的生理鹽水)。每組每天ig給藥1次，連續(xù)3 d給藥，末次給藥后禁食(12 h)，不禁水，再灌服1 d的量，1 h后，腹主動脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃，30min滅活處理后，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)

將復蘇后的A549,A549/DDP細胞以1×106/mL接種于25mL培養(yǎng)瓶中，加入4mL含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞基本長滿瓶壁后，用0．25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。實驗時取對數(shù)生長期細胞。

2.3 MTT法檢測含藥血清聯(lián)合順鉑對細胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期細胞按每孔2×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后分別加入受試物，繼續(xù)培養(yǎng)48h，實驗終止前4h加入MTT溶液(5mg·mL-1)20 μL,繼續(xù)孵育4 h，除去每孔培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，置搖床上振蕩10min至結(jié)晶溶解，酶標儀以490 nm為測定波長，測每孔吸光度(A)值。實驗設DDP組，含藥血清大劑量+DDP組，含藥血清中劑量+DDP組，含藥血清小劑量+DDP組，空白血清+DDP組，細胞對照組和空白對照組，每組均設3個復孔。DDP分10，20，40，80，100，200 μmol·L-16個濃度級，細胞對照為不加藥物的細胞懸液，空白對照為DMSO液。按改良寇式法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）∶lgIC50=Xm-I [P-(3-Pm-Pn)/4](Xm∶lg最大劑量，I∶lg(最大劑量/相臨劑量)，P∶陽性反應率之和，Pm∶最大陽性反應率，Pn∶最小陽性反應率)。按下式計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組/A空白對照組)/(A細胞對照組/A空白對照組)]×100%，耐藥倍數(shù)=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17軟件包進行One Way ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)用±s表示， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義,重復3次獨立實驗。

3 結(jié)果

參苓白術(shù)散含藥血清對肺腺癌耐藥細胞A549/DDP耐藥性的影響：

每組藥物處理48h后，參苓白術(shù)散含藥血清大、中、小劑量與DDP均存在協(xié)同作用，IC50和耐藥倍數(shù)均存在不同程度的降低，其中以中劑量組結(jié)果最為明顯(P＜0．01)，提示參苓白術(shù)散含藥血清可顯著逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP對DDP的耐藥，但無明顯改善DDP對A549的影響。

4 討論

參苓白術(shù)散全方補氣健脾，以治氣虛之本，升舉陽氣，調(diào)理全身氣機，為健脾益氣之首選方。臨床實踐表明，肺癌患者化療后常出現(xiàn)面色萎黃、惡心嘔吐、食少消瘦、神疲乏力等脾胃虛弱，氣血不足的表現(xiàn)，故改善肺癌耐藥當以健脾益氣為主[4,5]。

順鉑(DDP)是臨床上常用的抗癌藥物之一，具有較廣的抗瘤譜。肺癌細胞對DDP產(chǎn)生耐藥性，是化療失敗的主要原因之一。本實驗研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散含藥血清聯(lián)合DDP在體外有明顯的協(xié)同作用，可明顯降低A549/DDP對DDP的耐藥性，其中以參苓白術(shù)散等臨床劑量含藥血清(中劑量組)作用最為明顯，等臨床劑量組耐藥倍數(shù)由6.51倍下降至1.93倍，說明肺腺癌耐藥細胞經(jīng)參苓白術(shù)散含藥血清作用后發(fā)生了一系列生物學變化，使其對DDP的敏感性增強，具體作用機制還需進一步研究。

（作者單位：山東協(xié)和學院）

[1]郭其森.非小細胞肺癌內(nèi)科治療的現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2009,16(10):721.

[2]李瑞池.參苓白術(shù)散治療晚期肺癌的體會[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006,15(3):343.