基于可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)核病分子流行病學(xué)研究

孫雪娟 趙振國(guó) 鄧 平 張 宇 陳中秀 韓曉蓉 謝清波 王 玨

為了解吉林省結(jié)核桿菌的基因型多態(tài)性，以及各菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，本研究提取80例臨床患者的結(jié)核桿菌基因組對(duì)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）基因分型進(jìn)行分析研究。結(jié)果顯示重復(fù)單位（MIRU）及MIRU+乙烯受體蛋白基因（ETR）的成簇菌株比ETR的要少。研究證明，VNTR位點(diǎn)適用于結(jié)核桿菌基因分型，VNTR分型可以做為吉林省結(jié)核病分子流行病學(xué)研究有效方法。

結(jié)核桿菌；可變串聯(lián)重復(fù)序列；基因分型；流行病學(xué)

結(jié)核病屬于感染性疾病類型，主要有結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)，可在感染后長(zhǎng)期潛伏于機(jī)體中。傳統(tǒng)的流行病學(xué)方法在預(yù)測(cè)結(jié)核感染狀況中有一定的應(yīng)用價(jià)值，但是也受到明顯限制。近年來生物和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展為結(jié)核感染的診斷、爆發(fā)趨勢(shì)的預(yù)測(cè)等均提供了全新的契機(jī)，優(yōu)勢(shì)明顯［1］。基于此，本研究特選取80例確診為結(jié)核病的患者實(shí)施臨床試驗(yàn)，并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)狀況進(jìn)行分析，以期為結(jié)核分枝桿菌感染的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

選取吉林省大型綜合醫(yī)院門診2014年1月～2016年11月收治的80例確診為結(jié)核病患者的臨床痰標(biāo)本作為受試對(duì)象，取其痰液標(biāo)本。

1.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法

取合格的痰液標(biāo)本制備成痰涂片，經(jīng)過抗酸染色后實(shí)施鏡檢。將處理后的標(biāo)本混合均勻后在7H9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，充分混合均勻后取其中的200μl混合液加入微孔板中，添加50μl石蠟液體在37℃條件下培養(yǎng)，按照顏色變化觀察結(jié)核分枝桿菌感染情況。

采用改良羅氏培養(yǎng)法將痰標(biāo)本接種于培養(yǎng)基中，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)分型，將所得結(jié)核分枝桿菌菌株作為試驗(yàn)株備用。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗(yàn)方法

1.3.1 提取結(jié)核分枝桿菌的DNA 參照相關(guān)文獻(xiàn)提取結(jié)核分枝桿菌的DNA［2］，首先需要加入500μl降解溶液，并加入3μl蛋白酶K，混合均勻后預(yù)熱，采用ENA提取試劑盒并嚴(yán)格按照使用說明書步驟完成操作。

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 將上述操作所得樣品分別對(duì)結(jié)核分枝桿菌VNTR位點(diǎn)下ETR、MIRU及ETR+MIRU進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件均為：預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火45 s（溫度分別為60℃、58℃和65℃），延伸72℃ 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)操作，最終72℃條件下延伸10 min。

1.3.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物鑒定 采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件為：1.5%濃度瓊脂糖凝膠，100 V電壓，90 min，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察，并計(jì)算產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度。

1.4 VNTR位點(diǎn)多樣性分析及相關(guān)組合對(duì)菌株分辨能力評(píng)價(jià)

1.4.1 等位基因多樣性評(píng)價(jià) 等位基因多樣性分析公式：

其中n、χi值分別指實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)和在某個(gè)位點(diǎn)等位基因的頻率。

1.4.2 位點(diǎn)組合評(píng)價(jià) 參照公式［2］：

其中S、N和nj分別指實(shí)驗(yàn)菌株不同基因型數(shù)目、實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)及第j個(gè)基因型的菌株數(shù)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

本研究中80株結(jié)核分枝桿菌PCR結(jié)果顯示有44株屬于北京家族，其中42434和424353分別有27株和17株。

2.2 基因分型結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ETR、MIRU、MIRU+ETR分別有34株、22株、24株。

3 討論

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)分子流行病學(xué)的認(rèn)識(shí)和研究不斷深入，借助現(xiàn)代化檢驗(yàn)手段能夠?qū)χ虏【幕蛐瓦M(jìn)行檢測(cè)并借此評(píng)估不同基因型之間是否具有親緣性［3-4］。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，常將相同的基因形成的集合稱為“簇”，若成簇的菌株比較多，那么便可以據(jù)此確定其屬于相同的基因型，并且推測(cè)病原菌菌株具有明顯的爆發(fā)趨勢(shì)［5］。由此可知，通過利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌感染的基因型進(jìn)行檢測(cè)，分析某地區(qū)該致病菌感染是否具有爆發(fā)趨勢(shì)［6］。

MIRU技術(shù)是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因分型技術(shù)，在結(jié)核分枝桿菌基因分型檢測(cè)中占據(jù)重要的地位，較傳統(tǒng)的IS6110-RFLP技術(shù)操作更為簡(jiǎn)單且結(jié)果相對(duì)精確，顯示出良好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果顯示ETR 5個(gè)位點(diǎn)有6個(gè)基因型，而MIRU12和MIRU+ETR15個(gè)位點(diǎn)均有8個(gè)基因型，說明本研究中基因成簇?cái)?shù)較少，并且相對(duì)來說比較集中。此外ETR成簇菌株明顯多于其他兩個(gè)位點(diǎn)，說明分型效果及分辨率明顯不如MIRU及MIRU+ETR。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和筆者既往工作經(jīng)驗(yàn)分析其中原因?yàn)椋海?）所選樣本量較少，得出的結(jié)果并不具有代表性，仍需要選取大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)研究；（2）所有病例均來自吉林省地區(qū)，不具有代表性；（3）所用的方法以及檢測(cè)設(shè)備條件受到一定限制，且均受到基因分型方法分辨率的影響［7-8］。

與傳統(tǒng)的流行病學(xué)相比較，分子流行病學(xué)不僅能夠?qū)魅驹催M(jìn)行追蹤，同時(shí)還可以對(duì)其基因分型特點(diǎn)和檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，通過繪制系統(tǒng)性的進(jìn)化樹對(duì)優(yōu)勢(shì)感染菌株進(jìn)行詳細(xì)了解后明確致病菌感染的爆發(fā)趨勢(shì)。此外，在分子流行病學(xué)研究中還可以通過對(duì)成簇的基因型感染患者的社會(huì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行調(diào)查，從而確定結(jié)核病最為原始的感染源，以便及時(shí)控制感染結(jié)核分枝桿菌感染情況，降低結(jié)核病的發(fā)生率。

綜上所述，吉林省結(jié)核病分子流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)需要引起高度的重視，以便及時(shí)進(jìn)行預(yù)防和干預(yù)，此外采用新型的基因型檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)ζ浞肿恿餍胁W(xué)爆發(fā)趨勢(shì)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)結(jié)核病早期感染也可快速做出診斷。

［1］ 董毅，吳利先． 結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)的研究進(jìn)展［J］． 國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2013，40（5）：336-339．

［2］ 王春雨． 基因分型技術(shù)在梅花鹿結(jié)核病研究中的應(yīng)用［D］． 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：24．

［3］ 王春雨． 結(jié)核桿菌Taqman PCR檢測(cè)方法建立及吉林省鹿結(jié)核桿菌MLVA分型研究［D］． 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：31．

［4］ 譚云洪，趙秀芹，劉志廣，等． 湖南省231株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping和MLVA基因分型方法及其結(jié)果分析［J］． 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（10）：947-948．

［5］ 陳靖． 結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的鑒定及分型方法的建立及應(yīng)用［D］．上海：復(fù)旦大學(xué)，2009：39．

［6］ 張輝． 固定劑量復(fù)合劑應(yīng)用于結(jié)核病防治的分析［J］． 中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2015，7（11）：236-237．

［7］ 吳建勇，吳星星，楊學(xué)云，等． 綿羊副結(jié)核病的病原學(xué)檢測(cè)與分析［J］． 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53（8）：1562-1568．

［8］ 馬慧，胡屹，蔣偉利，等． 中國(guó)東部農(nóng)村地區(qū)結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的成簇性及耐藥特征研究［J］． 中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34（6）：447-450．

The Molecular Epidemiology of Tuberculosis Based on Variable Number Tandem Repeat Typing

SUN Xuejuan ZHAO Zhenguo DENG Ping ZHANG Yu CHEN Zhongxiu HAN Xiaorong XIE Qingbo WANG Jue Department of Clinical Laboratory，Changchun Infectious Disease Hospital，Changchun Jilin 130123，China

In order to understand the gene polymorphism of Jilin province Mycobacterium tuberculosis strains，and the evolutionary relationship，this study extracted 80 clinical patients with Mycobacterium tuberculosis genome for variable number of tandem repeats（VNTR）genotyping were analyzed． The results showed that strain mycobacterial interspersed repetitive units（MIRU）and MIRU clusters environmental tax reform（ETR）have less than ETR． Research showed that VNTR is suitable for genotyping of Mycobacterium tuberculosis，and VNTR typing can be used as an effective method to study the molecular epidemiology of tuberculosis in Jilin province．

Mycobacterium tuberculosis，VNTR，Genotyping，Epidemiology

R181．3

A

1674-9316（2016）36-0005-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．36．003

吉林省衛(wèi)生廳科研課題（2013Z038）

長(zhǎng)春市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130123