俞越錢(qián)（浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江　杭州310014）

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牛乳清結(jié)晶條件的探索及其結(jié)晶體形貌

俞越錢(qián)
（浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310014）

摘要：以脫脂及去酪蛋白的牛乳清為原料，利用紫外分光光度法及SDS-PAGE電泳技術(shù)，在pH 4.7～8.0，NaCl濃度0.5～2.0 mol/L條件下，對(duì)其結(jié)晶情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：牛乳清蛋白中的免疫球蛋白G（IgG）是一種理想的目標(biāo)蛋白，而pH 7.0則是得到IgG的理想pH。最后還利用了工業(yè)相機(jī)及熒光倒置顯微鏡對(duì)牛乳清結(jié)晶體進(jìn)行了拍攝，發(fā)現(xiàn)其中主要有長(zhǎng)方晶、四角晶、菱方晶三種結(jié)晶體形貌。

關(guān)鍵詞：牛乳清；結(jié)晶；結(jié)晶體形貌；免疫球蛋白

乳清蛋白是牛奶中重要的一類蛋白，其中主要包括IgG、乳鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、牛血清蛋白（BSA）等[1]，研究[2]表明：牛乳清中各類蛋白均具有一定的生物活性和功能，所以分離乳清蛋白成了至關(guān)重要。

層析是一種分離乳清蛋白的重要手段[3]，但是從工業(yè)角度來(lái)講，層析過(guò)程主要有兩個(gè)弊端：第一是設(shè)備成本高;第二是操作難度大。因此，找一種方法對(duì)工業(yè)層析過(guò)程做補(bǔ)充是有意義的。而結(jié)晶就是一種能補(bǔ)充層析的方法[5]。為此，要利用結(jié)晶方法得到乳清蛋白，首當(dāng)其沖的問(wèn)題就是選擇合適的結(jié)晶條件。

結(jié)晶過(guò)程的條件一般包括結(jié)晶劑、pH、溫度、攪拌速度等[6]。其中，結(jié)晶劑可為鹽[7-8]或有機(jī)試劑[9]。對(duì)于蛋白質(zhì)體系，NaCl是一種最常見(jiàn)的結(jié)晶添加物[10]，而且層析的洗脫過(guò)程中往往也要引入NaCl，它是一種常見(jiàn)的洗脫劑。那么，為了能與層析過(guò)程做對(duì)接，且不引入其他物質(zhì)致使體系更為復(fù)雜，本工作將NaCl作為牛乳清結(jié)晶劑。同時(shí)pH也是重要的條件之一，pH對(duì)乳清蛋白濃縮物（WPCs）的影響前人做過(guò)一些研究，如Lucena[12]和Bramaud[13]都利用了等電點(diǎn)沉淀法得到了WPCs中的α-乳白蛋白，沉淀中還含有少量的BSA以及免疫球蛋白（Igs）。顯然，在探索pH的影響時(shí)關(guān)注乳清蛋白的等電點(diǎn)對(duì)于本工作是非常必要且十分重要的。

目前為止，研究pH和鹽濃度對(duì)天然牛乳清體系結(jié)晶行為的影響還鮮有前人的文獻(xiàn)記載。本工作就將針對(duì)牛乳清體系，圍繞這兩個(gè)變量展開(kāi)研究與討論。最后還拍攝了牛乳清中的結(jié)晶體晶型。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用的牛奶來(lái)自蕭山牧場(chǎng)。BSA向德國(guó)Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(mǎi)。鹽酸，杭州雙林化工試劑廠，分析純。氫氧化鈉，杭州蕭山化學(xué)試劑廠，分析純。氯化鈉，上海申博化工有限公司，分析純。

1.2主要儀器

低溫恒溫槽（SC-15），寧波天恒儀器廠；紫外分光光度計(jì)（Ultrospec 3300 pro），Amersham Bioscience；SDS-PAGE電泳槽（Mini Protean 3 Cell），Bio-Rad。分析天平（BS 224 S），賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；大恒工業(yè)相機(jī)（DH-HV3103UC-T），北京大恒圖像視覺(jué)有限公司；熒光顯微鏡（CFM-500E），上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有有限公司。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1。

圖1　牛乳清結(jié)晶實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Figure.1 Crystallization experiment setup of bovine whey

1.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.3.1牛奶處理

將鮮牛奶在5000 r/min下離心30 min脫去脂肪，然后將其調(diào)至酪蛋白的等電點(diǎn)（pI）為4.6，在35℃的水浴恒溫加熱磁力攪拌器中溫浴攪拌50 min，使酪蛋白沉淀完全，將脫脂乳同樣在5000 r/min下離心30 min除去酪蛋白沉淀。最后乳清的pH調(diào)至5.8，并利用0.45 μm的微濾膜過(guò)濾。

1.3.2牛乳清結(jié)晶與分析

配成一定pH（4.7，5.8，7.0，8.0），NaCl濃度（0.5 mol/L，1.0 mol/L，1.5 mol/L，2.0 mol/L）的25 mL牛乳清。取15 mL該牛乳清放入100 mL的燒杯中，并將其置于低溫恒溫槽中降溫結(jié)晶。該降溫過(guò)程分為三個(gè)階段，恒溫，降溫，平衡。降溫速度分為兩種，先以0.1℃/min降溫，等接近成核點(diǎn)時(shí)利用0.01℃/min降溫，直至析出晶體。最后利用1 mL的移液槍取上清液至1.5 mL離心管中保存。接著利用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各上清液蛋白質(zhì)的量。最后取稀釋后的上清液80 μL至20 μL的上樣緩沖液（Loading buffer）中，利用100℃的水浴煮沸，接著做電泳，最后染色，脫色，拍照。

1.3.3牛乳清晶體拍攝

首先，將工業(yè)相機(jī)安裝于熒光顯微鏡上，接著調(diào)試顯微鏡焦距，最后對(duì)牛乳清溶液結(jié)晶體進(jìn)行拍攝。

2　結(jié)果與討論

2.1NaCl濃度和pH對(duì)成核溫度的影響

圖2是在不同pH下，成核溫度隨NaCl濃度改變的曲線。由圖可知，成核溫度會(huì)隨著鹽濃度的增加而增加，也就是說(shuō)鹽濃度越高，牛乳清就越容易析出蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象可以用Curtis等人[11]的蛋白質(zhì)-鹽相互作用理論來(lái)解釋。并且它與Alderton[7]對(duì)雞蛋清溶菌酶和Visuri[8]對(duì)淀粉酶的工作中出現(xiàn)的現(xiàn)象相類似。

圖2　不同pH下成核溫度隨鹽濃度的變化Figure.2 Temperature of nucleation versus NaCl concentration under different pH

圖3是不同NaCl濃度下，成核溫度隨pH改變曲線。由圖可知，在鹽濃度為0.5～1.5 mol/L，pH 7.0時(shí)最容易成核。但是在鹽濃度為2.0 mol/L時(shí)，成核溫度會(huì)隨著pH的增大而增大，并在pH 7.0之后趨于平緩。這也許是因?yàn)榕Ｈ榍逯械鞍椎闹饕煞质荌gG，而IgG的等電點(diǎn)是7.0[4]。所以在pH 7.0時(shí)析出的蛋白最多是比較合理的。而在高鹽濃度下，這種現(xiàn)象會(huì)被弱化。所以在2.0 mol/L鹽濃度下會(huì)出現(xiàn)這樣的趨勢(shì)。

圖3　不同鹽濃度下成核溫度隨pH的變化Figure.3 Temperature of nucleation versus pH at different NaCl concentration

2.2NaCl濃度和pH對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶量及收率的影響

圖4（a）和圖4（b）分別表示的是牛乳清中析出的蛋白質(zhì)的量隨鹽濃度的變化以及牛乳清中析出蛋白質(zhì)的回收率隨鹽濃度的變化。由于每次牛乳清結(jié)晶實(shí)驗(yàn)都是取15 mL牛乳清，所以上述蛋白質(zhì)的析出量以及產(chǎn)率都是以15 mL牛乳清為基準(zhǔn)的。從圖4（a）中可以看出乳清蛋白的析出量會(huì)隨著鹽濃度的升高而升高。而在圖4（b）中也有與圖4（a）相同的趨勢(shì)，從圖4（b）圖不難發(fā)現(xiàn)蛋白的最大析出量小于55 %，這主要有兩方面原因，一方面是因?yàn)槠胶鈺r(shí)間較短（0.5 h）。另一個(gè)原因是蛋白與水之間的作用力在一定階段后要大于蛋白與蛋白之間的作用力以及蛋白與鹽之間的作用力[24]，這樣就會(huì)影響蛋白之間的成團(tuán)。

圖4?。╝）

圖4?。╞）Figure.4

圖5（a）和圖5（b）分別表示牛乳清中析出的蛋白質(zhì)的量隨pH的變化以及牛乳清中析出蛋白質(zhì)的回收率隨pH的變化（以15 mL牛乳清為基準(zhǔn)）。從圖5（a）中可以看出pH 4.7和7.0時(shí)要比另外兩個(gè)pH時(shí)的析出量大，這是因?yàn)锽SA和IgG是牛乳清中含量最高的兩種蛋白，而兩種蛋白的等電點(diǎn)分別是4.7以及7.0。

圖5?。╝）

圖5　（b）Figure. 5

2.3NaCl濃度和pH對(duì)牛乳清中各蛋白含量的影響

圖6（a）和圖6（b）表示不同NaCl濃度和pH下牛乳清析出蛋白后上清液的SDS-PAGE電泳圖。從圖6（b）顯然可見(jiàn)，在pH 7.0時(shí)隨著鹽濃度的增加，IgG的量在明顯減小。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是因?yàn)镮gG的等電點(diǎn)在7.0左右，這時(shí)它最易沉聚析出。但如圖6（a），在pH 4.7時(shí)BSA并沒(méi)有出現(xiàn)類似于IgG的現(xiàn)象。

2.4牛乳清結(jié)晶體形貌

牛乳清是復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，為了能夠更好地利用結(jié)晶方法從牛乳清中得到蛋白質(zhì)，對(duì)牛乳清中結(jié)晶體晶型的觀察是必不可少的。

圖6　（a）

圖6?。╞）Figure.6

圖7　Figure. 7

如圖7（a）和圖7（b）中出現(xiàn)的是長(zhǎng)方晶，而圖7（c）中則是四角晶。這兩種晶型在蛋白質(zhì)結(jié)晶中是比較常見(jiàn)的。如雞蛋清溶菌酶在溶液結(jié)晶中會(huì)出現(xiàn)兩種典型的晶型[4]，一種是四角晶，另一種是長(zhǎng)方晶。而圖（d）出現(xiàn)的是菱方晶。之所以會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)晶體形貌是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是大分子物質(zhì)，其空間構(gòu)象十分復(fù)雜且易變。而在牛乳清體系中，不同作用力包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用力和鹽-蛋白質(zhì)作用力的共同作用下，蛋白質(zhì)構(gòu)象將變得更為復(fù)雜，這樣導(dǎo)致了結(jié)晶體晶格堆疊的過(guò)程中其長(zhǎng)出晶體形貌的不確定性的增加，最后才出現(xiàn)了這幾種不同的晶體形貌。

3　結(jié)論

本工作以脫除脂肪以及酪蛋白的牛乳清為原料，研究了pH以及NaCl濃度對(duì)其結(jié)晶的影響。發(fā)現(xiàn)IgG是一種理想的牛乳清結(jié)晶目標(biāo)蛋白，而pH 7.0則是得到這種目標(biāo)蛋白的理想pH。

最后還觀察到牛乳清中能得到四角晶、長(zhǎng)方晶、菱方晶等三種結(jié)晶體形貌。

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Exploration of Bovine Whey Crystallization Conditions and Morphology of Proteins Crystals

YU Yue-qian
（College of chemical engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou，Zhejiang 310014, China）

Abstract:With UV spectrophotometry and electrophoresis, degreased bovine whey after removal of casein was studied in conditions of pH 4.7～8.0 and 0.5～2.0 mol/L NaCl. The results showed that immunoglobulin（IgG) was a kind of ideal target protein in bovine whey. Meanwhile, pH 7.0 was the ideal pH to obtain IgG. Finally, the crystallization behavior of whey was surveyed by an inverted fluorescence microscope and a high resolution digital camera. Furthermore, three kinds of morphology including orthorhombic, tetragonal and rhombus crystals were observed.

Keywords:bovine whey; crystallization; morphology of crystals; immunoglobulin

作者簡(jiǎn)介：俞越錢(qián)（1990—），男，浙江紹興人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榉蛛x工程。E-mail:yyqsxf@163.com。

收稿日期：2015-05-22

文章編號(hào)：1006-4184（2016）1-0026-05