謝克恭唐毓金黃煜朗黃可陸路林佳杰盧賢哲

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不同濃度、作用時間白花蛇舌草注射液對MG-63細胞凋亡效果*

謝克恭①唐毓金①黃煜朗①黃可①陸路①林佳杰①盧賢哲①

【摘要】目的：探討白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細胞凋亡的誘導作用。方法：采用一定濃度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，將其配制成50、100、200、400 μL/mL 4種不同濃度的白花蛇舌草注射液，并注入到體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG-63細胞的培養(yǎng)液中。采用MTT法檢測不同濃度白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細胞作用12、24、48 h后的細胞增殖抑制率，并采用RT-PCR半定量檢測凋亡相關基因Bax的mRNA表達情況。同時擬用流式細胞儀（FCM）檢測白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細胞凋亡率。結果：MTT法檢測結果顯示，隨著白花蛇舌草注射液濃度和作用時間的不斷增加，人骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率均明顯增大；當白花蛇舌草注射液濃度達100 μL/mL時，隨著作用時間延長，Bax基因表達顯著升高（P＜0.05）。流式細胞儀檢測顯示，經(jīng)白花蛇舌草注射液處理后，人骨肉瘤MG-63細胞凋亡率隨白花蛇舌草注射液濃度的增加而不斷升高。結論：白花蛇舌草注射液通過上調Bax基因表達能誘導人骨肉瘤MG-63細胞凋亡，且隨著白花蛇舌草注射液濃度增加，人骨肉瘤MG-63細胞凋亡率亦不斷增加。

【關鍵詞】白花蛇舌草注射液； MG-63細胞； 細胞凋亡

①右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院 廣西 右江 533000

First-author’s address：Youjiang Medical College for Nationalities Affiliated Hospital，Youjiang 533000，China

在青少年中，骨肉瘤屬于較為常見的惡性骨腫瘤，在惡性腫瘤中約占20％，傳統(tǒng)治療方法主要包括新輔助化療、腫瘤切除或輔以化療[1]?；加泄侨饬龌颊?，其5年生存率可達70％～80％，但骨肉瘤仍屬于致殘率、病死率較高的一種惡性腫瘤，對人們的生命健康造成嚴重的威脅[2]。采用中藥輔助治療法，具有前景好、價格低廉、不良反應少，藥理作用廣泛等優(yōu)點。而中藥白花蛇舌草是一種茜草科耳草屬植物，中醫(yī)學認為，白花蛇舌草具有清熱解毒、活血散結、利水消腫的功效[3-5]。同時現(xiàn)代藥理學研究表明，白花蛇舌草主要含有機酸類、黃酮類、多糖類等成分，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及增強免疫力等作用。目前，國外對白花蛇舌草方面的研究很少，而國內(nèi)相對較多。據(jù)文獻[6]表明，白花蛇舌草能對腫瘤細胞具有誘導凋亡、體外抑制等作用。本研究通過體外培養(yǎng)MG-63細胞，將不同濃度（50、100、200、400μL/mL）白花蛇舌草注射液在不同時間（12、24、48 h）作用于該細胞，采用MTT法和流式細胞儀檢測其對MG-63細胞增殖抑制率和凋亡率，現(xiàn)將報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 白花蛇舌草注射液購自安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司（國藥準字號Z34020595，批號120601）；MTT、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；人骨肉瘤MG-63細胞由廣西醫(yī)科大學科學實驗中心惠贈，來自于中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；PBS（1×）、胰蛋白酶（1∶250）購自索萊寶科技有限公司；細胞培養(yǎng)瓶、15 mL離心管、96孔板（Corning公司）；TRIzol試劑（Invitrogen公司）；引物合成由大連寶生物工程有限公司完成；逆轉錄試劑（TaKaRa公司）2×Taq PCR MasterMix（KT201-01）MarkerI、SYBR試劑（TianGen公司）；8聯(lián)管（Axygen公司）。

1.3 實驗儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱MDF-U72V、MCO-18AIC（日本SANYO公司）；生物安全柜BHC-1300ⅡA/83（蘇凈集團安泰公司）；電熱恒溫水槽DK-8D型（上海精宏實驗設備有限公司）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；倒置顯微鏡（Leica型號DMIL），酶標儀（Nultiskan MK3 Thermo），PCR儀（BIO-RAD）；水浴箱；搖床。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤MG-63細胞接種于培養(yǎng)瓶，加入10％（體積分數(shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL，置于5％ CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4.2 MTT法檢測 取對數(shù)生長期的細胞，并用0.25％胰酶消化，消化后加入培養(yǎng)基（DMEM）5 mL并吹打成混懸液，計數(shù)后調整細胞濃度，取150 μL（5×103個）接種于96孔板。采用一定濃度的乙醇提取白花蛇舌草有效成分，將其配制成濃度為50、100、200、400 μL/mL 4種不同的白花蛇舌草注射液，現(xiàn)配現(xiàn)用。待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度含藥液，并設立空白對照組（僅加入相同的培養(yǎng)基），每組5個復孔[7-9]。培養(yǎng)24 h后，加入20 μL的5 mg/mL MTT，再培養(yǎng)4 h后棄去含藥液，加入150 μL DMSO，37 ℃恒溫搖床震蕩10 min后，在酶標儀上492 nm波長測定吸光度（A）值，取平均值，并計算細胞抑制率。計算公式：細胞增殖抑制率＝（對照組A值-藥物組A值）/對照組A值×100％。

1.4.3 Bax基因表達

1.4.3.1 提取總RNA 取對數(shù)生長期細胞，并調整為1×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁后，加入100 μL/mL含藥培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)時間分別為12、24、48 h，根據(jù)Trizol提取試劑說明書提取總RNA。采用紫外分光光度計測量總RNA濃度，取A260/A280在1.80～2.20用于RT-PCR。

1.4.3.2 cDNA合成 參照逆轉錄試劑盒說明，將RNA逆轉成cDNA。

1.4.3.3 PCR檢測 25.0 μL反映體系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ 12.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。將25.0 μL設5復孔，并加入8聯(lián)管中，采用PCR儀行擴增，95 ℃變性30 s，95 ℃ PCR反應50 s、63 ℃退火30 s，共計40個循環(huán)的PCR反應，重復實驗3次，反應結束后，計算2-△△Ct值[10-12]。具體見表1。

表1　Bax基因PCR反應2-△△Ct值

1.4.4 流式細胞儀檢測 取對數(shù)生長期細胞數(shù)為5×106/mL的MG-63細胞，分別接種于4個50 mL細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細胞貼壁后換液?？瞻讓φ战M加入4 mL新鮮培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的白花蛇舌草注射液（50、100、200、400 μL/mL）。48 h后，均加入0.25％胰蛋白酶消化細胞，并采用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次（離心5 min，2000 r/min），收集細胞2×105個細胞后，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL的Annexin-V-FITC，均勻混合后，加入5 μL碘化丙啶（PI），均勻混合后，室溫避光反應10 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學處理 本次統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（％）表示，比較采用 χ2檢驗或確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的白花蛇舌草注射液對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的抑制作用 MTT法檢測結果顯示：白花蛇舌草注射液對MG-63細胞的抑制作用呈依賴關系，當其濃度200 μL/mL時，作用24 h后，大部分細胞脫落、變圓、死亡。當濃度為50 μL/mL時，抑制作用不明顯（P＞0.05），而濃度為100 μL/mL時，具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。在倒置顯微鏡下觀察濃度為100 μL/mL白花蛇舌草注射液對MG-63細胞不同作用時間的細胞形態(tài)，空白對照組細胞狹長、形態(tài)多樣，緊密地貼壁生長，實驗組（12、24、48 h）細胞隨著作用時間延長，細胞逐漸皺縮且細胞間間隔變大，增殖被抑制，見表2。

表2　不同濃度的白花蛇蛇注射液對人骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率（±s）?。?/p>

表2　不同濃度的白花蛇蛇注射液對人骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率（±s）?。?/p>

組別　　孔數(shù)　　作用時間12 h　24 h　48 h對照組　5　-　-　-50 μL/mL　 5　 2.83±2.24 13.41±2.18 30.82±3.65 100 μL/mL　 5　 22.27±1.56 43.36±2.88 66.42±2.60 200 μL/mL　 5　 45.32±2.14　 -　-400 μL/mL　 5　-　-　-

2.2 Bax基因表達 PCR檢測結果顯示，取100 μL/mL白花蛇舌草注射液分別作用于MG-63細胞12、24、48 h后，Bax基因表達水平分別為（5.370±0.386）、（7.750±0.293）、（16.950±0.331），均明顯高于空白對照組的（1.00±0.00），組間數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且呈時間依賴性，提示白花蛇舌草注射液抑制細胞增殖可能通過上調Bax基因表達而實現(xiàn)的。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 將分別與50、100、200、400 μL/mL白花蛇舌草注射液作用48 h 的MG-63細胞用Annexin-V-FITC和碘化丙啶雙染后，采用流式細胞儀對細胞的凋亡情況進行分析。結果實驗組細胞凋亡率分別為17.71％、19.16％、23.42％、31.25％，與空白對照組的0.61％、0.45％、0.33％、0.17％比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

細胞凋亡是在凋亡信號作用下，由基因調控細胞主動死亡的過程，其形態(tài)主要表現(xiàn)為染色質凝聚邊集、形成凋亡小體及細胞固縮[13-15]?，F(xiàn)代研究認為，采用藥物治療腫瘤，主要是通過誘導細胞凋亡而實現(xiàn)治療的目的。Bax基因屬于Bcl-2基因家族中的一種促進基因，具有調節(jié)細胞凋亡的作用，且能表達于多種腫瘤細胞中，其抗腫瘤機制是通過改變線粒體膜通透性，使細胞中的小分子物質及色素C進入細胞質中，從而激活Caspase-3，導致與DNA修復及細胞周期等相關蛋白失活而實現(xiàn)細胞凋亡[16-18]。若Bax基因過度表達，則會形成Bax-Bax二聚體，誘導細胞凋亡；而Bcl-2基因表達增高，則會形成Bax-Bcl-2二聚體，將會使細胞凋亡被抑制。因此，從一定程度上來看，Bax基因與Bcl-2基因的比例將決定細胞是否凋亡[19-21]。

白花蛇舌草是一種茜草科耳草屬植物，具有清熱解毒、利水消腫的功效。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草的主要成分包括有機酸類、黃酮類、多糖類等成分，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及增強免疫力的作用[22-23]。白花蛇舌草注射液為中藥白花蛇舌草提取支撐的單味藥滅菌水溶液。本研究發(fā)現(xiàn)濃度為100 μL/mL的白花蛇舌草注射液作用12 h后，MG-63細胞逐漸縮小、核深染，隨著作用時間延長，細胞邊緣、懸浮死亡，與蔣章等[24]學者研究結果一致。PCE檢測結果顯示，促凋亡的Bax基因高表達，表明白花蛇舌草注射液抑制細胞增殖抑制可能通過上調Bax基因表達而實現(xiàn)的。

抗癌藥物本身的細胞毒副作用是一個較為棘手的問題。因此，能尋找到抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，且毒副作用小的天然藥物具有非常重要的意義[25]。本研究結果肯定了白花蛇舌草對人骨肉瘤MG-63細胞的體外抑制和誘導作用，但其發(fā)揮作用的組成成分及抑制腫瘤細胞的增殖和促進細胞凋亡的機制尚不明確，有待進一步研究證實。

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Effect of Different Concentration and Action Time Spreading Hedyotis Herb Injection Induced Mg-63 Cells Apoptosis

/XIE Ke-gong，TANG Yu-jin，HUANG Yu-lang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（03）：001-004

【Abstract】Objective：To explore the effect of spreading hedyotis herb injection of bone sarcoma MG-63 cells apoptosis induction.Method：With a certain concentration of ethanol extraction of spreading hedyotis herb active ingredients，the mixture concentration of 50，100，200，400 μL/mL four different spreading hedyotis herb injection. And its injection into different concentrations of bone sarcoma MG-63 cells in vitro culture. Determined by MTT method was used to detect the different concentration of spreading hedyotis herb injection effect on bone sarcoma MG-63 cells，12，24 and 48 h after cell proliferation inhibition rate，and USES the quantitative RT-PCR detection of apoptosis related gene Bax mRNA expression. Cells and decodes the （FCM） spreading hedyotis herb injection of bone sarcoma with MG-63 cell apoptosis rate.Result：Determined by MTT method to detect the result shows that，with the spreading hedyotis herb injection concentration and action time，increasing bone sarcoma with MG-63 cell proliferation inhibition rate were significantly increased，when the concentration of spreading hedyotis herb injection up to 100 μL/mL，with the duration extension，Bax gene expression was significantly higher （P＜0.05）. Flow cytometry instrument detection showed that after spreading hedyotis herb injection treatment，bone sarcoma with MG-63 cells apoptosis rate with the increase of the concentration of spreading hedyotis herb injection and rising.Conclusion：Spreading hedyotis herb injection via increased Bax gene expression can induce bone sarcoma with MG-63 cell apoptosis，and with the increase of concentration of spreading hedyotis herb injection，bone sarcoma with MG-63 cells apoptosis rate also increased.

【Key words】Spreading hedyotis herb injection； MG-63 cells； Cell apoptosis

收稿日期：（2015-06-23） （本文編輯：蔡元元）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.001

通信作者：唐毓金

*基金項目：廣西醫(yī)學科學實驗中心開放基金課題（KFJJ2011-01）