王士沖常青鄭帥楊西雨劉亞鐘衛(wèi)權(quán)

?

不同強度的運動對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的骨代謝機制的研究*

王士沖①常青①鄭帥①楊西雨①劉亞①鐘衛(wèi)權(quán)①

【摘要】目的：通過不同強度運動對去卵巢大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1表達的影響，探討運動對去卵巢骨質(zhì)疏松癥的影響機制。方法：將大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松模型組、30 min運動組和60 min運動組，運動組持續(xù)訓(xùn)練8周。處死大鼠，取血清進行測試。結(jié)果：與正常對照組比較，8周訓(xùn)練后，骨質(zhì)疏松模型組和30 min運動組大鼠體重顯著增加（P＜0.05），而60 min運動組大鼠體重增加不明顯。此外，與正常對照組比較，骨質(zhì)疏松模型組大鼠的OPG、IGF-1的表達明顯降低，RANKL表達明顯升高（P＜0.01）。60 min運動組的OPG和IGF-1的水平與骨質(zhì)疏松模型組大鼠比較有顯著升高（P＜0.01），30 min運動組大鼠的OPG也有升高（P＜0.05）。結(jié)論：運動對去卵巢大鼠破骨細胞分化傳導(dǎo)通路OPG、RANKL的表達有一定調(diào)節(jié)作用，IGF-1可能參與了對OPG的調(diào)節(jié)，并對去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥有一定的防治作用。

【關(guān)鍵詞】骨質(zhì)疏松； 運動； OPG； RANKL； IGF-1

①徐州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 江蘇 徐州 221004

First-author’s address：The Technical School of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是指由于絕經(jīng)或年老所致的骨質(zhì)疏松癥，其病理特征是骨組織所有骨的顯微結(jié)構(gòu)受損，骨礦成分和骨基質(zhì)等比例地不斷減少，骨質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加和骨折危險度升高。我國目前已有9000多萬骨質(zhì)疏松癥患者，總患病率為12.4％，其中骨折發(fā)生率為27.5％～32.6％。隨著老齡化社會的到來，該病發(fā)病率呈逐年上升之勢。絕經(jīng)后婦女由于卵巢分泌雌激素減少，骨代謝紊亂，常可引起骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。運動作為一種良性的刺激，可以改善和調(diào)節(jié)骨的代謝。本研究通過建立去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，采用不同強度的跑臺訓(xùn)練，研究運動對大鼠骨代謝機制的影響，為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的細胞分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取3月齡清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠60只（由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體重（240±15）g，大鼠按體重分層隨機分為五組：正常對照組、假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松模型組、中等負荷（30 min）運動組、大負荷（60 min）運動組，每組12只。每籠5只，飼養(yǎng)籠選用塑料制品，并配用不銹鋼罩，玻璃吸水瓶和不銹鋼吸水管，飼養(yǎng)溫度21～24 ℃。國家標準固定混合飼料喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2 實驗方法及指標測定

1.2.1 卵巢切除方法 假手術(shù)組行假手術(shù)，按體重腹腔注射10％水合氯醛麻醉，行背部肋下入路，將雙側(cè)卵巢提出腹腔，不切除，然后放回腹腔縫合切口，安靜狀態(tài)下常規(guī)喂養(yǎng)，不進行運動訓(xùn)練。骨質(zhì)疏松模型組、30 min運動組和60 min運動組行去卵巢術(shù)，按假手術(shù)組方法找出雙側(cè)卵巢并將其切除。1.2.2 運動方法 30 min運動組：切除卵巢1周后進行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，開始10 min/次，適應(yīng)后30 min/次，5次/周，共進行8周。60 min運動組：跑臺條件與30 min運動組相同，60 min/次，5次/周，共8周。正常對照組、假手術(shù)組和骨質(zhì)疏松模型組正常飼養(yǎng)。大鼠訓(xùn)練用跑臺購自上海繼德實驗教學(xué)器械廠（型號：JD-PT型）。

1.3 檢測方法 全部動物在運動組大鼠末次訓(xùn)練后麻醉下處死。腹主動脈取血，將收集的全血室溫靜置2 h后，3000 r/min，離心20 min，分離血清，-80 ℃保存。血清RANK、OPG和IGF-1的Elisa試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司，所有指標的測定均根據(jù)試劑盒操作要求進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗前后大鼠體重變化的比較 大鼠訓(xùn)練前，各組大鼠體重?zé)o明顯差異。經(jīng)過8周訓(xùn)練后，骨質(zhì)疏松模型組大鼠和30 min運動組大鼠的體重與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 實驗前后大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1含量的比較 8周運動訓(xùn)練后，骨質(zhì)疏松模型組大鼠血清中OPG水平低于正常組和假手術(shù)組，RANKL的分泌量高于正常對照組和假手術(shù)組，IGF-1的水平明顯低于正常對照組（P＜0.01）。8周運動訓(xùn)練后，30 min運動組大鼠除了OPG的血清含量高于骨質(zhì)疏松模型組（P＜0.05），RANKL和IGF-1的水平與其他組均無明顯差異；60 min運動組大鼠血清中OPG和IGF-1的水平均高于骨質(zhì)疏松模型組大鼠（P＜0.01），RANKL則相反（P＜0.01），見表2。

表1　實驗前后大鼠體重變化的比較（±s） g

表1　實驗前后大鼠體重變化的比較（±s） g

*與正常對照組比較，P＜0.01；△P＜0.01，#P＜0.05，與假手術(shù)組比較

組別　　實驗前　　實驗后正常對照組（n＝12）　247.03±18.65　 334.75±23.41假手術(shù)組（n＝12）　231.64±11.17　 344.86±19.08骨質(zhì)疏松模型組（n＝12）　237.97±22.04　 386.54±30.35*△30 min運動組（n＝12）　240.34±12.48　 373.86±29.69*#60 min運動組（n＝12）　239.24±13.06　 340.14±18.33

表2　實驗前后大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1含量的比較（±s） ng/L

表2　實驗前后大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1含量的比較（±s） ng/L

*與正常對照組比較，P＜0.01；△與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與骨質(zhì)疏松模型組比較，P＜0.05

組別　OPG　RANKL　 IGF-1正常對照組（n＝12）　0.15±0.34　 0.21±0.18　 0.19±0.32假手術(shù)組（n＝12）　0.13±0.12　 0.23±0.11　 0.18±0.11骨質(zhì)疏松模型組（n＝12）0.09±0.21*△0.29±0.41*△0.14±0.22*△30 min運動組（n＝12）0.12±0.16#　0.25±0.29　 0.16±0.13 60 min運動組（n＝12）0.16±0.11#　0.22±0.21#　0.20±0.19△#

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，在8周以后骨質(zhì)疏松模型組大鼠與正常對照組比較，體重有明顯增加，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[1-2]。其原因可能是卵巢摘除后，血中雌激素水平降低，腎上腺分泌雌酮，在脂肪組織中加速轉(zhuǎn)化為雌激素以彌補血中不足，引起體內(nèi)脂質(zhì)代謝失常，脂肪堆積造成肥胖[3]。30 min運動組的大鼠體重與假手術(shù)組比較有明顯增加，這可能與運動負荷不夠有關(guān)。

骨質(zhì)疏松是一種由骨重建過程失衡導(dǎo)致，主要病理表現(xiàn)為松質(zhì)骨骨小梁變細、斷裂和數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。骨組織結(jié)構(gòu)的這些病理改變不僅使骨量減少，且使骨質(zhì)量下降，明顯影響骨的機械功能，致生物力學(xué)性能降低。有證據(jù)顯示女性的骨量丟失開始于絕經(jīng)前2～3年，隨著雌激素分泌的不斷減少在絕經(jīng)后加劇，這個過程將持續(xù)5～10年[4-5]。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在破骨細胞激活、生成、分化和成熟的過程中起著決定性作用，是非常重要的破骨細胞分化調(diào)節(jié)通路[6]。大鼠去卵巢后，雌激素分泌量減少，骨的吸收增加，骨形成減少。骨保護素（OPG）是RANKL/RANK信號通路的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，OPG廣泛分布于人和動物的多種組織細胞中，許多細胞如骨髓間質(zhì)細胞、成骨細胞、成纖維細胞、主動脈平滑肌細胞、成骨肉瘤細胞等均可分泌OPG，其可與過量的RANKL結(jié)合，防止RANK活化，抑制破骨細胞活性[7]。OPG的表達受多種代謝調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，如IL-1、TNF-α、TGF-β等能增加破骨細胞的表達，而各種刺激骨吸收的因子如由PTH通過促進成骨細胞表達RANKL，降低表達OPG介導(dǎo)的[8]。RANKL是破骨細胞前體細胞分化為成熟破骨細胞的必需因子，可促進破骨細胞分化，增強成熟破骨細胞活力，阻止破骨細胞凋亡。RANKL主要由骨髓間質(zhì)細胞和成骨細胞分泌，破骨細胞不分泌RANKL。RANKL的受體RANK 是一種跨膜蛋白，主要存在于骨髓巨噬細胞的表面[9-10]。運動可以改善血液OPG/RANKL的比例，影響成骨細胞和破骨細胞數(shù)目或活性，導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)改變。有實驗研究表明，250 km超長距離跑后第3天，血清破骨細胞分化因子（RANKL）和OPG水平較運動前有所上升[11]。此外，正向研究還發(fā)現(xiàn)雌激素可通過調(diào)節(jié)EphB4/EphrinB2信號通路抑制破骨細胞分化，說明雌激素對骨破壞有抑制作用[12]，李麗輝等[13]的研究也表明3個月的持續(xù)運動，去卵巢大鼠骨組織的OPGmRNA的表達顯著高于模型組大鼠。何淑敏等[14]通過對生長期大鼠進行12周的耐力性運動訓(xùn)練，結(jié)果顯示OPG水平高于對照組。本實驗中8周實驗后，骨質(zhì)疏松模型組大鼠的OPG含量明顯低于正常對照組，而60 min運動組大鼠血清OPG的含量明顯高于骨質(zhì)疏松模型組，RANKL的水平低于骨質(zhì)疏松模型組（P＜0.01），其機制可能是規(guī)律性的運動訓(xùn)練提高OPG的分泌，提高了OPG/RANKL的比例，能夠改善大鼠由于去卵巢而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥狀。30 min運動組的大鼠8周運動訓(xùn)練后，OPG的水平高于骨質(zhì)疏松模型組（P＜0.05），而RANKL的分泌量與模型組差異不顯著，這可能與運動的負荷有關(guān)。

IGF-1是骨骼中含量最豐富的生長因子之一，是包括成骨細胞在內(nèi)多種細胞的促有絲分裂劑，它以自分泌和旁分泌的形式調(diào)節(jié)骨骼細胞的功能，促進成骨細胞增殖、分化和募集，抑制細胞凋亡，刺激骨膠原的轉(zhuǎn)錄和DNA合成，抑制膠原的降解，增加骨基質(zhì)沉積。Thomas等[15]使用IGF-1刺激體外培養(yǎng)的基質(zhì)細胞（hBMSC，是骨髓中具有分化潛能的非造血細胞，能進一步分化為成骨細胞），發(fā)現(xiàn)IGF-I以及它們的受體活性類似物能顯著促進hBMSC的增殖和分化。本實驗中8周訓(xùn)練后，60 min運動組大鼠血清中IGF-1的水平高于骨質(zhì)疏松模型組，并且與OPG的水平成正相關(guān)，而與RANKl的水平成負相關(guān)，說明IGF-1促進骨細胞的增長，抑制骨的吸收，其可能的機制還待進一步的研究。

參考文獻

[1]李世昌，季瀏，劉體偉，等，不同方式運動對去卵巢大鼠骨密度、骨生物力學(xué)及代謝指標的影響[J].體育學(xué)刊，2012，19（2）：132-137.

[2]李長天，王雅莉，陳雁飛，等.葛根素對去卵巢大鼠體重及大腦海馬CA1區(qū)CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2012，10（32）：4426-4428.

[3]李洪洋.去勢雌鼠固執(zhí)骨質(zhì)疏松模型研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)，1992，17（19）：1-3.

[4] Dalle Carbonare L，Valenti M T，Zanatta M，et al. Circulating esenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis[J].Arthritis Rheum，2009，60（11）：3356-3365.

[5]王俊玲，黃思敏，梁啟瑤，等.雌激素的來源及其在骨代謝中的作用[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2015，6（21）：729-732.

[6]查小云，胡予.骨質(zhì)疏松相關(guān)信號通路研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20（2）：205-209.

[7]丁從珠，姚瑤，方蕓，等.青藤堿對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠血清OPG/RANKL、IL-17含量的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，28（4）：330-333.

[8] Huang J C，Sakata T，Hleger L L，et al.PTH differentially regulates expression of RANKL and OPG[J].J Bone Miner Res，2004，19（4）：235-244.

[9] Asanuma Y，Chung C P，Oeser A，et al. Serum osteoprotegerin is increased and independently associated with coronaryartery atherosclerosis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Atherosclerosis，2007，195（2）：e135-e141.

[10] Silva I，Branco J C. RNAK/RANKL/OPG：literature review[J]. Acta Reumatol Port，2011，36（3）：209-218.

[11] Kerschan-Schindl K，Thalmann M，Sodeck G H，et al. A 246-km continuous running race causes significant changes in bone metabolism[J]. Bone，2009，45（6）：1079-1083.

[12]史淇月，楊柳，魏鉑沅，等.雌激素通過調(diào)節(jié) EphB4/EphrinB2信號參與破骨細胞分[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20（4）：347-352.

[13]李麗輝，楊杰，董潔瓊，等.運動對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠OPG、RANKL表達的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（11）：991-996.

[14]何淑敏，陳明.耐力訓(xùn)練對生長期大鼠血清OPG，sRANKL及骨代謝生化因子、骨量的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（5）：560-562.

[15] Thomas T，Gori F，Spolsberg T G，et al.Response of bipotential human marrow stromal cells to insulin-like factors：effect on binding protein production，proliferation and commitment to osteoblasts and adipocytes[J].Endocrinology，1999，50（36）：5044.

The Research on Different Load Exercise to the Bone Mechanism of Osteoporosis in Ovariectomized Rats

/WANG Shi-chong，CHANG Qing，ZHENG Shuai，et al.//Medical Innovation of China，2016，13 （03）：022-024

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of exercise in treating osteoporosis by detecting the osteoprotegrin（OPG），receptor activator of nuclear factor kappa B ligand （RANKL）and insuline growth factor-1（IGF-1）. Method： Female Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group，sham-operated group，model group，30 min exercise group and 60 min exercise group，and the exercise group continuous training 8 weeks. The rats were executed，the serum were tested. Result：After 8 weeks，compared with the control group，the weight of the model group and 30 min exercise group increased raised significantly （P＜0.05）. Compared with the control group，the expression of OPG and IGF-1 decreased much significantly in the model group，and the RANKL increased apparently（P＜0.01）. The OPG and IGF-1 in 60 min exercise group increased much significantly compared with that of the model group （P＜0.01），the OPG also increased in the 30 min exercise group （P＜0.05）.Conclusion： Exercise can regulate OPG and RANKL expression in osteoclast differentiation pathway to ovarian rats，IGF-1 may be involved in the regulation of OPG. Exercise can prevent and treat osteoporosis in ovariectomized rats.

【Key words】Ovariectomized rats； Exercise； OPG； RANKL； IGF-1

收稿日期：（2015-05-12） （本文編輯：蔡元元）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.007

通信作者：鐘衛(wèi)權(quán)

*基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201310313001）