王慧煜,梅　琳,王　晶,李　琳,黃金海*,韓雪清*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100029；2.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300072)

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新型葡萄球菌腸毒素多重PCR檢測方法的建立

王慧煜1,梅琳1,王晶1,李琳2,黃金海2*,韓雪清1*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100029；2.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300072)

摘要:針對新發(fā)現(xiàn)的SEO、SEQ、SER、SEU等4個葡萄球菌腸毒素基因型，分析比對GenBank中報道的序列，設(shè)計特異性引物，進一步通過調(diào)節(jié)退火溫度、模板濃度和多重PCR引物濃度等，優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系，建立了同時檢測4種金黃色葡萄球菌腸毒素的多重PCR檢測方法。該方法可同時擴增出4種新的腸毒素基因，與其他基因型無交叉反應(yīng)，對SEO、SEQ、SER、SEU檢測的敏感性分別達到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg?？蓪π滦推咸亚蚓c毒素進行快速、準(zhǔn)確的檢測與分型。

關(guān)鍵詞:葡萄球菌；腸毒素；多重PCR；檢測

葡萄球菌(Staphylococcus)是引起食物中毒最普遍的細菌之一，是動物性食品的重要致病菌，廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其他環(huán)境。因此，食品受其污染的機會很多。引起葡萄球菌食物中毒的主要物質(zhì)是其產(chǎn)生的一種外毒素，葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)。葡萄球菌腸毒素食物中毒是個世界性衛(wèi)生問題，美國、加拿大等國家，葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占所有食物中毒事件病原的50%，是最常見的食物中毒類型。我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，全國各地均有報道。

自從1959年葡萄球菌腸毒素被證實以來，除了最早被人們發(fā)現(xiàn)和熟知的5種腸毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE和毒性休克綜合癥毒素1(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)外，近幾年又發(fā)現(xiàn)了SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新的腸毒素[1-3]。相關(guān)研究已證明，新發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌腸毒素基因出現(xiàn)的頻率很高，Becker K等[4]研究表明，如果葡萄球菌腸毒素的檢測擴展到新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因，葡萄球菌的檢出率會提高22.2%。因此，新發(fā)現(xiàn)的腸毒素引起的食物中毒應(yīng)引起足夠的重視。目前已報道的葡萄球菌腸毒素已達20余種，但國內(nèi)外研究報道的檢測技術(shù)局限于傳統(tǒng)葡萄球菌腸毒素基因，尚缺乏對不同毒素型尤其是新型毒素系統(tǒng)分型的檢測技術(shù)，容易出現(xiàn)葡萄球菌的漏檢問題，為口岸進出境動物產(chǎn)品中葡萄球菌的檢測帶來困難。

本研究擬利用多重PCR技術(shù)的高效擴增性，建立同時檢測4種新型葡萄球菌腸毒素基因的PCR方法，以便對葡萄球菌腸毒素進行快速、準(zhǔn)確的檢測與分型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株葡萄球菌產(chǎn)腸毒素SEO、SEQ、SER、SEU的菌株和產(chǎn)其他腸毒素的菌株由天津大學(xué)化工學(xué)院提供；腸炎沙門菌、痢疾志賀菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、腸毒素型大腸埃希菌購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2試劑DNA提取試劑盒(TIAamp Bacteria DNA Kit)為北京天根有限公司產(chǎn)品；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit和Plasmid Mini Kit為OMEGA有限公司產(chǎn)品；E.coliCompetent Cells JM109、DNA Maker DL 2 000、dNTP Mixture和TaKaRaTaqTM為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品；PGEM-T Easy Vector Systems為Promega公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計參照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中公開發(fā)表的SEO、SEQ、SER、SEU核酸序列，通過Bioedit軟件進行比對，應(yīng)用Prmer5.0和OMIGA軟件設(shè)計4對引物[3]。參照文獻[5]的方法合成葡萄球菌腸毒素通用的16 S rDNA引物。

1.2.2模板DNA的提取參照TIAamp Bacteria DNA Kit說明書提取葡萄球菌產(chǎn)SEO、SEQ、SER、SEU菌株和其他待檢菌株DNA。

1.2.3檢測葡萄球菌腸毒素的多重PCR反應(yīng) 的建立根據(jù)引物的Tm值設(shè)定了多個退火溫度，包括47、49、51、53 ℃和55 ℃，分別在不同退火溫度下同時擴增各目標(biāo)片段。上、下游引物分別按照1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例加入，同時擴增各目標(biāo)片段。分別加入0.5、1、2、3、4、5 μL模板DNA，同時擴增各目標(biāo)片段。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物用15 g/L~20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳25 min，紫外檢測擴增產(chǎn)物，進行結(jié)果分析。

1.2.4特異性試驗用上述方法對腸炎沙門菌、痢疾志賀菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、腸毒素型大腸埃希菌進行特異性檢測試驗。

1.2.5敏感性試驗 將金黃色葡萄球菌在LB肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)6 h后提取DNA，用紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm下的OD值，換算成DNA濃度。將DNA分別進行10倍梯度稀釋后，采用優(yōu)化的多重PCR體系進行檢測。

1.2.6田間樣品試驗對采集自不同口岸的動物產(chǎn)品中分離到的68株葡萄球菌進行新型腸毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU檢測。

2結(jié)果

2.1單重PCR擴增結(jié)果

葡萄球菌腸毒素SEO、SEQ、SER、SEU基因擴增后獲得的片段與預(yù)期大小完全一致，分別為756、222、168、442、319 bp(圖1)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1. 16 S rDNA；2. SEO；3. SEQ；4. SER；5. SEU；6.陰性對照

M. DNA Marker DL 2 000；1. 16 S rDNA；2. SEO；3. SEQ；4. SER；5. SEU；6. Negative control

圖1各基因PCR擴增結(jié)果

Fig.1The PCR results of genes

2.2多重PCR擴增結(jié)果

分別在47、49、51 、53 、55 ℃條件下同時擴增各目標(biāo)片段。結(jié)果顯示，在51 ℃時擴增條帶清晰，大小片段差異明顯。上、下游引物分別按照1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例對各目標(biāo)片段進行擴增，發(fā)現(xiàn)上、下游引物的比例為1∶1時，5個擴增條帶全部清晰。分別加入0.5、1、2、3、4、5 μL模板DNA，同時擴增各目標(biāo)片段，結(jié)果表明加入2 μL模板DNA時，擴增的所有條帶清晰，容易分辨。通過優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，最終形成的反應(yīng)體系和程序如下：

多重PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×buffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，上游引物(10 pmol/μL) 1 μL，下游引物(10 pmol/μL) 1 μL，模板DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 μL，雙蒸水補齊至25 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。產(chǎn)腸毒素SEO、SEQ、SER、SEU的菌株混合后，提取DNA進行多重PCR擴增。結(jié)果如圖2所示，可同時擴增出756、222、168、442 bp和319 bp特異性條帶，并且差異明顯、清晰易分。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1. 混合菌株；2. 16 S rDNA；3. SER；4. SEU；5. SEO；6. SEQ

M. DNA Marker DL 2 000；1. Mixture of bacteria；2. 16 S rDNA；3. SER；4. SEU；5. SEO；6. SEQ

圖2多重PCR擴增結(jié)果

Fig.2The multiplex PCR results of SEO，SEQ，SER，SEU genes

2.3特異性試驗

用上述方法對腸炎沙門菌、痢疾志賀菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、腸毒素型大腸埃希菌進行特異性檢測試驗。腸炎沙門菌、痢疾志賀菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、腸毒素型大腸埃希菌的檢測結(jié)果均為陰性，未擴增出任何條帶。而混合菌株可以同時擴增出5個條帶，說明該多重PCR能特異性地擴增出產(chǎn)腸毒素SEO、SEQ、SER、SEU基因的特異性片段(圖3)，而不能擴增出其他常見細菌。

2.4敏感性試驗

產(chǎn)腸毒素SEO、SEQ、SER、SEU的金黃色葡萄球菌在LB肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)6 h后提取的DNA濃度分別為1.45×106、2.34×106、1.89×106、2.09×106pg。分別經(jīng)10倍倍比稀釋后進行多重PCR，結(jié)果如圖4所示，所建立的多重PCR對SEO、SEQ、SER、SEU檢測的敏感性分別達到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.混合菌株；2.腸炎沙門菌；3.痢疾志賀菌；4.副溶血性弧菌；5.奇異變形桿菌；6.腸毒素型大腸埃希菌；7.陰性對照

M. DNA Marker DL 2 000；1. Mixture of bacteria；2.Salmonellaenteritidis；3.Shigelladysenteriae； 4.Vibrioparahemolyticus；5.Proteusmirabilis；6. EnterotoxigenicE.coli；7. Negative control

圖3多重PCR特異性試驗

Fig.3Specificity test of the multiplex PCR

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性對照；2. 107pg；3. 106pg；4. 105pg；5. 104pg；6. 103pg；7. 102pg；8. 10 pg；9. 1 pg；10. 陰性對照

M. DNA Marker DL 2 000；1. Positive control；2. 107pg；3. 106pg；4. 105pg；5. 104pg；6. 103pg；7. 102pg；8. 10 pg；9. 1 pg；10. Negative control

圖4多重PCR敏感性試驗

Fig.4Sensitivity test results of the multiplex PCR

2.5田間樣品試驗

對采集自不同口岸的動物產(chǎn)品中分離到的68株葡萄球菌，提取DNA后，采用本研究建立的多種PCR檢測方法，進行新型腸毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU的檢測。從圖5統(tǒng)計結(jié)果看，在分離的68株葡萄球菌中，SEQ檢出率最高，約占全部菌株的22.6%，其次分別是SEO(15.2%)、SEU(11.9%)和SER(8.1%)。

圖5　各型腸毒素基因檢出率

3討論

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起食物中毒的一種重要細菌，能夠在很寬廣的溫度范圍(7 ℃~48.5 ℃)，pH(4.2~9.3)，高鹽(NaCl濃度高達150 g/L)的環(huán)境中存活，這些特性使葡萄球菌很容易通過各種途徑和方式，在動物產(chǎn)品、食品和飼料等制備和加工過程中造成污染。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測腸毒素的方法，廣泛應(yīng)用于各型腸毒素的檢測。然而，ELISA檢測腸毒素時，葡萄球菌A蛋白、內(nèi)源性酶類、基質(zhì)蛋白可以導(dǎo)致假陽性反應(yīng)的發(fā)生。分子生物學(xué)方法在腸毒素基因檢測、研究腸毒素基因的表達情況和各型之間的關(guān)系，深入認(rèn)識其毒素性質(zhì)方面的重要作用日益凸顯[6]，國內(nèi)外均有有采用PCR方法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素基因的報道[2-3, 7-9]。但目前報道的腸毒素基因PCR檢測方法，大多是針對單一基因的方法，由于葡萄球菌分布的廣泛性及新型腸毒素基因不斷產(chǎn)生及其多樣性，使研究針對多種葡萄球菌腸毒素基因的多重檢測方法的需求變得尤為突出。本研究通過對GenBank中報道的新型腸毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU的序列進行分析比對，設(shè)計了不同型基因檢測的特異性引物，并進一步通過調(diào)節(jié)退火溫度、模板濃度和多重PCR引物濃度等措施，優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系，建立了同時檢測4種金黃色葡萄球菌腸毒素的多重PCR檢測方法。PCR技術(shù)作為一種靈敏、快速簡便而且經(jīng)濟實用的檢測方法已經(jīng)在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是多重PCR技術(shù)倍受青睞，當(dāng)樣品數(shù)量大、檢測目標(biāo)多時，多重PCR顯示出獨特的優(yōu)勢，能夠高通量、低成本的進行批量快速檢測多個目標(biāo)。

以前對葡萄球菌腸毒素的研究多集中在SEA-SEE等常見毒素功能及檢測方法的研究[2, 10-11]，對新近發(fā)現(xiàn)的腸毒素功能的研究不多[12]。目前，SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO等基因已被克隆或發(fā)現(xiàn)[13-15]。最近又不斷有更新的SE樣腸毒素發(fā)現(xiàn)，對新發(fā)現(xiàn)的基因分布研究剛剛起步。國外最新的相關(guān)研究已證明新發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌腸毒素基因出現(xiàn)的頻率很高[2]。本研究是針對新發(fā)現(xiàn)的SEO、SEQ、SER、SEU等4個基因建立的多重PCR檢測方法，可同時擴增出4種新的腸毒素基因，與其他基因型無交叉反應(yīng)，并且對SEO、SEQ、SER、SEU檢測的敏感性分別達到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg。此4個不同基因型的敏感度不完全一致也有待提高，可能與多對引物之間的相互影響有關(guān)，這也是下一步要進行的研究工作之一。

用本研究建立的多重PCR方法，對田間分離的68份樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)各種基因型均有檢出，其中SEQ檢出率最高，約占全部菌株的22.6%，其次分別是SEO(15.2%)、SEU(11.9%)和SER(8.1%)。檢測結(jié)果進一步證明了所建立方法的可靠性與穩(wěn)定性，為葡萄球菌病防控提供有效的早期快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)，因此在維護公共衛(wèi)生安全方面具有十分重要的意義。

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Establishment of Multiplex PCR for Simultaneous Detection of New Entertoxin Genotypes ofStaphylococcus

WANG Hui-yu1,MEI Lin1,WANG Jing1,LI Lin2,HUANG Jin-hai2,HAN Xue-qing1

(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing,100029,China;2.SchoolofLifeScience,TianjinUniversity,Tianjin,300072,China)

Abstract:Our study designed 4 pairs of primers to detect 16 S rDNA and SE genes(SEO, SEQ, SER, SEU) based on bioinformatics analyzing, optimized conditions of PCR amplification and staphylococcal genome extraction to establish a systematic approach to rapid and simultaneous detection of different genotypes of SEs by multiplex PCR method. The sensitivity and specificity of the method were evaluated with different entertoxin genotypes of Staphylococcus and other standard bacterial isolates. The results showed that the method was very specific and sensitive.The sensitivities for detecting SEO,SEQ,SER and SEU reached 1.45×102, 2.34×103, 1.89×102and 2.09×102pg.The method can detect and type novel staphylococcal enterotoxins rapidly and accurately

Key words:Staphylococcus;entertoxin genotype;multiplex PCR;detection

文章編號:1007-5038(2016)02-0019-04

中圖分類號:S852.611

文獻標(biāo)識碼:A

作者簡介：王慧煜(1978-)，女，山西祁縣人，高級獸醫(yī)師，博士,主要從事微生物分子生物學(xué)研究。*通訊作者

基金項目：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2012IK027)；國家科技支撐計劃課題(2012BAK11B04)

收稿日期：2014-11-14