于　江, 杜以軍, 李　俊, 叢曉燕, 孫文博, 時(shí)建立, 陳　智, 陳　蕾, 吳家強(qiáng)*, 王金寶*

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

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副豬嗜血桿菌ompP2基因在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

于江1,2, 杜以軍1,2, 李俊1,2, 叢曉燕1,2, 孫文博1,2, 時(shí)建立1,2, 陳智1,2, 陳蕾1,2, 吳家強(qiáng)1,2*, 王金寶1,2*

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

摘要:為了進(jìn)一步研究副豬嗜血桿菌(HPS)ompP2基因的功能，根據(jù)已發(fā)表的副豬嗜血桿菌核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增HPS LZ株外膜蛋白o(hù)mpP2基因，獲得大小為1 158 bp的核苷酸片段，該片段純化后克隆至pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化后鑒定，再與真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo經(jīng)過酶切和連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans-T1，雙酶切鑒定，篩選陽性重組質(zhì)粒并測(cè)序。通過脂質(zhì)體法將pCI-neo-ompP2轉(zhuǎn)染豬肺泡巨噬細(xì)胞，通過RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)重組質(zhì)粒是否表達(dá)。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了含ompP2基因的副豬嗜血桿菌真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2，提取轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的豬肺泡巨噬細(xì)胞的mRNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在1 000 bp~2 000 bp之間可見1條明顯的條帶。Western blot發(fā)現(xiàn)在42 ku處出現(xiàn)目的條帶。試驗(yàn)結(jié)果為后期研究副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:副豬嗜血桿菌；ompP2基因；真核表達(dá)載體；豬肺泡巨噬細(xì)胞；表達(dá)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)是豬上呼吸道的常在菌，能夠從健康豬的鼻、氣管及扁桃體中分離得到，在正常條件下并不表現(xiàn)臨床癥狀。在機(jī)體遭受應(yīng)激或感染病毒性疾病(如高致病性豬藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒感染、豬瘟)導(dǎo)致免疫力下降時(shí)，寄生在豬呼吸道部位的HPS毒力菌株則發(fā)生細(xì)菌定植和侵襲，引起機(jī)體發(fā)病[1-2]。1901年，Gl?sser首次報(bào)道HPS能引起發(fā)病豬的多發(fā)性漿膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎[3]。近幾年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化的發(fā)展，該病以繼發(fā)的方式存在于各規(guī)?；i場，并呈逐年上升趨勢(shì)，增加了斷奶到保育階段仔豬的發(fā)病率及死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一。

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMP)是革蘭陰性菌外膜的重要組成成分。目前，國內(nèi)外許多專家學(xué)者也相繼對(duì)OMP進(jìn)行了不同的研究，發(fā)現(xiàn)OMP與HPS的毒力有關(guān)，而且從健康仔豬與患病豬中分離到的OMP不同，從患有多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎癥狀的病豬體內(nèi)分離的OMP基本相同，并說明ompP2可用于區(qū)分毒力株與非毒力株。HPS基因缺失株ΔompP5與野生型菌株比較生長較緩慢，但兩者對(duì)豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(porcine umbilical vein endothelial cells, PUVEC)和豬腎上皮細(xì)胞(porcine kidney，PK-15)的黏附性與侵襲力并沒有顯著差異[4-5]。

近年來，對(duì)HPS的致病機(jī)理與毒力因子的研究更加受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，但HPS的毒力因子及其致病機(jī)理仍不明確。目前，作者所在實(shí)驗(yàn)室已通過抑制消減雜交的方法確定ompP2基因是HPS的毒力基因[6]。本試驗(yàn)通過構(gòu)建HPS ompP2基因的真核表達(dá)載體，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而確定其能在豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAM)中表達(dá)，該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究ompP2基因在宿主細(xì)胞中的作用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株HPS分離株LZ株(血清5型)，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.1.2細(xì)胞、質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞PAM細(xì)胞(3D4/2)、真核表達(dá)載體pCI-neo、感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑T4 DNA Ligase，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ為美國Thermo公司產(chǎn)品；dNTP，DNA Marker DL 2 000，DL 5 000、Trizol等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TransStart FastPfu DNA Polymerase為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Flag標(biāo)簽鼠的單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗為Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(NC膜)為上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒、SuperScriptTM Ⅱ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.4引物合成根據(jù)GenBank中HPS菌株SH0165全基因組序列(登錄號(hào)：CP001321)，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物兩端分別引入XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物上游起始密碼子前加入Flag序列，擴(kuò)增片段為1 158 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

注：下劃線代表酶切位點(diǎn)；斜體代表Flag序列。

Note: The underline represents the enzyme digestion sites; Italics represents the Flag sequences.

1.2方法

1.2.1PCR擴(kuò)增采用直接煮沸法從HPS培養(yǎng)液中提取DNA，PCR反應(yīng)體系為50μL，其中10×buffer 10 μL、2.5×dNTP 5 μL(2.5 μmol/L)、10 μmol/L引物P1、P2各2 μL、Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1 μL，DNA模板2 μL，去離子水28 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2PCR擴(kuò)增片段的克隆鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明切膠回收目的片段，與pEASY-Blunt載體連接，并轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑選轉(zhuǎn)化長出的菌落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2的構(gòu)建及鑒定分別用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅡ雙酶切含有目的基因的pEASY-Blunt和pCI-neo質(zhì)粒，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明切膠回收，以純化目的基因和pCI-neo線性質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，并將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，分別取1.25、2.5、5 μg真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2和5 μg pCI-neo空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染密度為80%PAM細(xì)胞的六孔板，37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基上清，細(xì)胞沉淀用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，置-80 ℃保存。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)Trizol法提取PAM細(xì)胞總RNA，按照SuperScriptTM Ⅱ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6Western blot試驗(yàn)用常規(guī)方法裂解細(xì)胞，SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用Flag標(biāo)簽鼠的單克隆抗體作為一抗，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗，顯色，觀察條帶。

2結(jié)果

2.1ompP2基因的擴(kuò)增結(jié)果

以HPS分離株LZ株DNA為模板，擴(kuò)增ompP2基因，通過10 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)可見大小為1 158 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR product; 2. Negative control

圖1PCR擴(kuò)增目的條帶

Fig.1PCR amplification of target gene

2.2真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2的酶切鑒定

XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-ompP2，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收約1 160 bp的基因片段，與相同酶切的線性真核表達(dá)載體pCI-neo連接，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果可見約1 160 bp和5 500 bp 2個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)，陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序成功的質(zhì)粒命名為pCI-neo-ompP2。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Eukaryotic expression vector pCI-neo-ompP2

圖2重組質(zhì)粒酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

提取轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2的PAM細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見約1 160 bp的核酸條帶，與目的條帶大小一致(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；3.陽性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-PCR amplification products of eukaryotic expression vector pCI-neo-ompP2 transfected PAM cells; 2.Negative control; 3.Positive control

圖3真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2

轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3 RT-PCR amplification results of eukaryotic expression

vector pCI-neo-ompP2 transfected PAM cells

2.4Western blot 檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜，分別用Flag標(biāo)簽鼠的單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為一抗和二抗，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果如圖4所示，在硝酸纖維素膜上40 ku～50 ku之間出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致。

圖4　真核表達(dá)載體pCI-neo-ompP2轉(zhuǎn)染

3討論

近年來，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)等能引起免疫抑制疾病的病毒存在時(shí)，副豬嗜血桿菌(HPS)繼發(fā)感染的病例越來越多，常常引起發(fā)病豬出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化，甚至急性死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，明確HPS的毒力基因及其感染宿主細(xì)胞致病機(jī)理十分必要。

目前，國內(nèi)外關(guān)于HPS感染宿主細(xì)胞的研究越來越多。HPS能夠黏附并入侵豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAM)、豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(porcine umbilical vein endothelial cells,PUVEC)、豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(porcine brain microvascular endothelial cells, PBMEC)。Chen Y S等[7]用HPS感染豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)發(fā)現(xiàn)HPS能夠通過Toll樣受體激活NF-κB信號(hào)通路。Zhou S等[8]發(fā)現(xiàn)HPS能夠誘導(dǎo)PAM細(xì)胞炎性細(xì)胞因子(IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8)上調(diào)。然而，HPS的這種黏附與入侵宿主細(xì)胞的能力是否與毒力因子相關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期在豬體內(nèi)進(jìn)行了HPS與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)共感染試驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)豬體感染PRRSV時(shí)，更容易繼發(fā)HPS感染，從而引起更嚴(yán)重的肺部病變，出現(xiàn)更嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎和毛細(xì)血管出血，肺臟HPS含量升高[9]。由此可見，PAM細(xì)胞是HPS感染豬體過程中主要的宿主細(xì)胞，能夠?yàn)镠PS與PRRSV共感染的作用機(jī)制研究提供新的思路。

外膜蛋白(OMP)是革蘭陰性菌外膜的重要組成成分，在致病性和免疫原性方面發(fā)揮著重要的作用，其中ompP2不但具有維持細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性等功能，還參與細(xì)菌的致病過程，如黏附、入侵、抵抗補(bǔ)體殺菌和促進(jìn)炎癥反應(yīng)等[10]。在HPS中，OMP是潛在的毒力因子，具有很好的免疫原性，其中ompP2在HPS的OMP中的含量最為豐富[11]。研究推斷ompP2蛋白可作為區(qū)分HPS毒力的一個(gè)參考指標(biāo)[12]，但目前這方面研究報(bào)道較少。

本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的HPS LZ株的DNA為模板，擴(kuò)增出ompP2基因片段，并克隆至真核表達(dá)載體pCI-neo中，轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞后，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明HPS的ompP2可以在PAM細(xì)胞中表達(dá)，具有抗原性。本研究旨在探討HPS的ompP2能否在宿主細(xì)胞PAM中表達(dá)，并為進(jìn)一步研究其毒力相關(guān)性及開展外膜蛋白受體介導(dǎo)的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制奠定了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Expression ofHaemophilusparasuisompP2 Gene in Porcine Alveolar Macrophages

YU Jiang1,2, DU Yi-jun1,2, LI Jun1,2, CONG Xiao-yan1,2, SUN Wen-bo1,2, SHI Jian-li1,2,CHEN Zhi1,2, CHEN Lei1,2, WU Jia-qiang1,2, WANG Jin-bao1,2

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong, 250100,China;2.ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan,Shandong, 250100,China)

Abstract:In order to study the function of Haemophilus parasuis (HPS) ompP2 gene, a pair of primers were designed and synthesized according to nucleotide sequence of HPS ompP2 gene. The ompP2 gene of HPS LZ was amplified strain. The amplified ompP2 gene was cloned into pEASY-Blunt vector. The ompP2 gene was sequenced and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo. The recombinant plasmid was used to transform competent Trans-T1 and the positive clones were identified by restriction enzyme digestion. Thus, the recombinant pCI-neo-ompP2 was transfected to porcine alveolar macrophages (PAM) . The expression of pCI-neo-ompP2 was detected by RT-PCR and Western blot. The result showed that a 1 158 bp ompP2 gene fragment was amplified from the HPS DNA. The eukaryotic expression vector pCI-neo-ompP2 containing ompP2 gene was constructed successfully. The 1 000-2 000 bp DNA was amplified from the mRNA extracted from the PAM transfected with pCI-neo-ompP2 by RT-PCR and the 42 ku protein was detected by Western blot. This study provided an experiment fundation for studying the mechanism which HPS infects PAM.

Key words:Haemophilus parasuis; ompP2 gene; eukaryotic expression vector; porcine alveolar macrophage; expression

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0011-14

中圖分類號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡介：于江(1985-)，女，山東萊州人，助理研究員，主要從事動(dòng)物微生物與免疫學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015YL078)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育計(jì)劃(2014CGPY04)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(2015YQN51)

收稿日期：2015-06-15