霍雨霞薩玉龍楊相政

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

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簡(jiǎn)易方法制備復(fù)合蛋白酶樣品

霍雨霞1薩玉龍1楊相政2

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

摘要：本實(shí)驗(yàn)在幾種常見(jiàn)蛋白酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）單酶水解效果比較基礎(chǔ)上，按一定比例配制復(fù)合酶進(jìn)行水解，通過(guò)測(cè)定水解液的水解度、透光度和過(guò)濾速度檢測(cè)水解效果，得出水解效果最優(yōu)的復(fù)合蛋白酶，結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用試驗(yàn)效果明顯。此方法適合應(yīng)用研發(fā)能力較弱、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單的中小型酶制劑企業(yè)簡(jiǎn)易制備復(fù)合蛋白酶樣品，在短時(shí)間內(nèi)給客戶(hù)提供酶制劑樣品。

關(guān)鍵詞：復(fù)合蛋白酶；應(yīng)用研發(fā)；樣品

蛋白酶來(lái)源豐富，除從動(dòng)、植物中提取外，還可由細(xì)菌大量發(fā)酵生產(chǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、制革、繅絲等工業(yè)，也可作為重要的生化試劑[1,2]。例如木瓜或菠蘿蛋白酶用作啤酒穩(wěn)定劑，能消除由于啤酒冷藏而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀等。酶解法是一種新興的動(dòng)物蛋白生產(chǎn)方法，因酶解法優(yōu)點(diǎn)較多，很多食品企業(yè)已廣泛采用。

由于酶的催化具有專(zhuān)一性，使得單酶不符合許多工藝要求，因此復(fù)合酶的使用無(wú)疑是酶制劑行業(yè)的必然趨勢(shì)[3]。目前我國(guó)酶制劑工業(yè)主要存在的問(wèn)題是復(fù)合酶制劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)力度不夠[4]，制約了酶制劑企業(yè)的市場(chǎng)開(kāi)拓能力，尤其是中小型酶制劑企業(yè)，無(wú)法擔(dān)負(fù)高額的試驗(yàn)研發(fā)設(shè)備和檢測(cè)設(shè)備，危及企業(yè)自身的生存和發(fā)展。因此，盡快提高復(fù)合酶應(yīng)用技術(shù)，努力提高產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，是許多中小型酶制劑企業(yè)必經(jīng)之路。

本文以水解豬肉蛋白為例，在單酶水解基礎(chǔ)上，采用三種常用蛋白酶配制復(fù)合蛋白酶，測(cè)定水解液的水解度、透光度、過(guò)濾速度等，檢測(cè)復(fù)合酶水解效率，從而快速制備水解豬肉蛋白的復(fù)合蛋白酶樣品，試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用效果顯著，可視為企業(yè)根據(jù)簡(jiǎn)單的應(yīng)用試驗(yàn)效果，在短時(shí)間內(nèi)配制酶制劑樣品較好的方法。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

市售新鮮豬肉餡兒，冷藏備用。

1.2主要試劑

磷酸鹽緩沖液pH 6.81，硼酸緩沖液pH 9.18；

中性蛋白酶（5.0×104IU/g），南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶，肇東市酶制劑廠；

木瓜蛋白酶（2.0×105IU/g），南寧龐博生物工程有限公司。

1.3主要設(shè)備

凱氏定氮儀（KDN-04A），上海荊和分析儀器有限公司；

恒溫水浴鍋，電子天平，pHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

WH7410-50B型電動(dòng)攪拌器，天津市威華儀器設(shè)備有限公司；

紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；

TD-4K-6K-10K高速離心機(jī)，上海趙迪生物科技有限公司。

1.4測(cè)定方法

可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用凱氏定氮法，具體測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]；

透光度：660nm處透光度T，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)6；

水解度（DH）計(jì)算公式如下[7]：

過(guò)濾速度測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)8。

1.5水解工藝流程

1.5.1預(yù)處理

室溫下，稱(chēng)取新鮮豬肉餡兒50g于250mL燒杯中，加水100mL，攪拌均勻，將燒杯置于水浴鍋中，升溫至80～90℃，保溫10min后，將燒杯置于涼水中降溫至40℃，調(diào)節(jié)料液pH為7.0。

1.5.2水解條件

在處理好的料液中添加酶，添加量為豬肉餡兒質(zhì)量的0.3％，置于溫度50～55℃的恒溫水浴鍋中水解，攪拌機(jī)（150r/min）勻速攪拌，水解3h后，料液加熱煮沸10min滅酶，靜置冷卻，離心（2000r/min）取上清液，測(cè)定水解度、透光度和過(guò)濾速度。

1.6復(fù)合酶配比

試驗(yàn)對(duì)比5種復(fù)合酶水解效果，其組成配比見(jiàn)表1。

2　結(jié)果與分析

2.1單酶與復(fù)合酶水解效果的比較

2.1.1單酶與復(fù)合酶水解度的比較

以中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單酶水解豬肉蛋白的水解效果作為對(duì)照，配制復(fù)合酶I號(hào)、II號(hào)、III號(hào)在相同酶解條件下水解3h，每30min測(cè)定豬肉蛋白水解液的水解度和透光度以及每10mL水解液的過(guò)濾時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

表1　三種蛋白酶復(fù)合酶配比

圖1　單酶與復(fù)合蛋白酶水解豬肉蛋白水解度的比較

反應(yīng)進(jìn)行60min左右時(shí)，單酶和復(fù)合酶水解速度相當(dāng)，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到90min時(shí)，中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單酶的水解度已經(jīng)達(dá)到60％左右，且隨著水解時(shí)間的增加，水解度已經(jīng)沒(méi)有明顯的增加，而90min時(shí)，復(fù)合蛋白酶I號(hào)、II號(hào)、III號(hào)水解液的水解度分別為78.23％、70.01％、85.49％，尤其是復(fù)合蛋白酶III號(hào)在反應(yīng)120min時(shí)，水解度為94.22％，與木瓜蛋白酶單酶的水解度相比增加了約35.4％，與復(fù)合蛋白酶I號(hào)最大水解度相比增加了12.19％，說(shuō)明復(fù)合酶水解效果比單酶水解效果好，且復(fù)合酶III號(hào)水解效果最好。

2.1.2單酶與復(fù)合酶透光度的比較

圖2　單酶與復(fù)合蛋白酶豬肉蛋白水解液透光度比較

此外，從圖2可以看出，酶解反應(yīng)結(jié)束后，復(fù)合酶III號(hào)水解液的透光度最大，為91.30，因此選用復(fù)合酶III號(hào)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.1.3單酶與復(fù)合酶過(guò)濾速度的比較

圖3　單酶與復(fù)合蛋白酶豬肉蛋白水解液過(guò)濾速度比較

由圖3可以看出，過(guò)濾速度復(fù)合酶III（1）最慢，為58s/10mL，因此其水解效果最好。

2.2不同配比的復(fù)合酶III號(hào)水解效果測(cè)定

將不同配比的復(fù)合酶III，在相同酶解條件下對(duì)豬肉蛋白進(jìn)行水解3h，每30min測(cè)定豬肉蛋白水解液的水解度、透光度和水解液的過(guò)濾速度，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

圖4　復(fù)合酶III號(hào)不同配比水解度的比較

圖5　復(fù)合酶III號(hào)不同配比水解液透光度的比較

從圖4可得出，復(fù)合酶III（1）號(hào)水解效果優(yōu)于其他三種，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到120min時(shí)，水解度已達(dá)94.22％。

根據(jù)圖5、圖6可得出，復(fù)合酶III（1）號(hào)水解進(jìn)行3h后，水解液的透光度最高，為91.3％，過(guò)濾速度為58s/10mL，與其他幾種配比水解效果相比較，效果最佳。

圖6　復(fù)合酶III號(hào)不同配比水解液過(guò)濾速度的的比較

2.3確定最佳復(fù)合蛋白酶制劑樣品

按照以上試驗(yàn)結(jié)果，得出水解效果最佳復(fù)合蛋白酶為復(fù)合酶III（1）號(hào)，其配方為木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:胰蛋白酶=1:1:1，樣品建議添加量為0.3％，水解料液pH 7.0，水解溫度50～55℃，水解時(shí)間為3h。

3　結(jié)論

1）本試驗(yàn)所用三種蛋白酶單酶水解效果比均復(fù)合酶水解效果差，因此，在具體應(yīng)用中應(yīng)重點(diǎn)考慮復(fù)合酶制劑水解豬肉蛋白進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2）根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出的水解豬肉蛋白復(fù)合酶的優(yōu)選配比為木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶=1:1:1，復(fù)合酶的添加量為0.3％，水解料液pH 7.0，水解溫度50～55℃，水解3h時(shí)，此條件下，水解度最高可達(dá)94.22％，水解液透光度為91.3，水解液過(guò)濾時(shí)間速度為58s/10mL。

參考文獻(xiàn)：

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The Simple Method of Preparing Compound Proteinase Sample

HUO Yu-xia1SA Yu-long1YANG Xiang-zheng2
(1.Hulunbeier Vocational Technical College,Hulunbeier 021000,China;2.Jinan Fruit Research Institute,All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Took the hydrolysis of pork for example to prepare the compound proteinase sample,the concrete method was that prepared the compound proteinase according to a certain proportion based on the hydrolysis result of single factor test (papain,neutrase,trypsin),then tested the degree of hydrolysis,the transmittance of light and the filtration of hydrolysate to check the results.Prepared the compound proteinase sample according to the results in a short time and supplied with the clients.The results showed that the method was efficient,easy and quick,suitable for small and medium enterprises with simple equipments and short of development capabilities.

Key words:Compound proteinase;development capabilities;sample

作者簡(jiǎn)介：霍雨霞（1984—），女，講師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2014CQ019）

收稿日期：2015-07-08

中圖分類(lèi)號(hào)：TS214

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1038(2016)02-0017-03