葛邦國　宋　燁

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

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蘋果渣中蘋果多酚柱層析分離工藝研究

葛邦國宋燁

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

摘要：本文研究了大孔吸附樹脂對蘋果渣中蘋果多酚純化和Sephadex凝膠對蘋果多酚的精制工藝參數(shù)，選定AB-8為純化用大孔吸附樹脂，采用70％乙醇作為解吸劑；Sephadex凝膠精制后的蘋果多酚，經(jīng)冷凍干燥，得到蘋果多酚粉末。蘋果多酚得率為0.12％，蘋果多酚的純度由初步純化的15.5％提高到75.6％。

關鍵詞：蘋果多酚；大孔樹脂；純化；精制

植物多酚的提取純化工藝，一般采用乙醇提取，真空濃縮，然后樹脂吸附進行初步純化，但這種方法能耗高，過程長，產(chǎn)品純度不高[1,2]。隨著功能成分提取技術的發(fā)展，多酚的提取純化更多的采用柱層析技術，使用大孔吸附樹脂和Sephadex凝膠，以提高產(chǎn)品純度[3,4]。近年來，大孔吸附樹脂在植物功能性成分提取純化中的研究和應用日漸增多，顯示出了獨特的吸附和洗脫特性，這一技術既可提高樣品供試液純度，也可減少有毒有機溶劑的使用[5-7]。Sephadex凝膠屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)，適合于不同類型有機物的分離，性質(zhì)穩(wěn)定，易實施循環(huán)操作。本文研究了大孔吸附樹脂對蘋果渣中蘋果多酚純化和Sephadex凝膠對蘋果多酚的精制工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗所用材料為經(jīng)微波法或超臨界二氧化碳提取得到的蘋果多酚粗提物。大孔吸附樹脂X-5、AB-8、NKA9、HD400，購于天津南開大學化工廠；Folin-Ciocalteu試劑，購于Sigma公司；綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒食子酸等物質(zhì)，均購自于Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

島津UVmini-1240紫外/可見分光光度計（日本）；RE1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，常州市國立試驗設備研究所（中國）；2BV循環(huán)水式多用真空泵，北京融合立盛科技有限公司（中國）；HZX-HA型水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造有限公司（中國）；LC2200S分析天平（德國）；TDL-5-A高速離心機，上海安亭儀器廠（中國）；層析柱（1.6cm×40cm)），無錫兆陽化工裝備有限公司（中國）。

1.3蘋果多酚的測定

選擇Folin酚法測定蘋果多酚。酚類物質(zhì)的含量采用高效液相色譜測定，標樣為綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒食子酸。色譜分析條件：Kromasil C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈（A）和水（B）；柱溫30℃；進樣量10μL；流速1.0mL/min。紫外檢測器檢測，波長280nm。

表1　梯度洗脫條件

1.4大孔吸附樹脂的預處理[8]

選取的四種大孔吸附樹脂分別用95％乙醇室溫浸泡24h后，裝柱，首先用95％乙醇洗滌，至流出溶液加水不呈白色混濁，再用蒸餾水脫除乙醇。接著用2BV的5％ HCl淋洗并浸泡4h，水洗至中性；再用2BV的2％NaOH溶液淋洗并浸泡4h，水洗至中性。

1.5Sephadex G25預處理

SephadexG25在使用之前將凝膠溶脹于層析溶劑中至少3h。先用2～3個柱體積的洗脫液進行清洗。凝膠柱的填裝在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱。將處理好的凝膠在燒杯內(nèi)用1倍體積的洗脫液攪拌成懸浮液，自柱頂部沿管內(nèi)壁緩緩加入柱。

1.6測定指標及方法

樹脂的吸附量（mg/g）及解吸率（％）計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附解吸試驗

2.1.1大孔樹脂的篩選

準確稱取已處理好的AB-8、X-5、HD400、NKA四種樹脂各2.0g于150mL三角瓶中，分別加入40mL 0.866mg/mL蘋果多酚提取液，置于水浴恒溫振蕩器上，40℃、150r/min振蕩，在1、2、3、4、5h設定時間取樣測定，以吸附量、時間作圖。

由圖1可知，HD400、NKA和X-5起始吸附能力較差，隨著時間的延長，吸附量緩慢上升；AB-8起始吸附量較大，此后吸附量增加較快，在4～5h內(nèi)即可基本達到平衡。從圖中可看出，AB-8對蘋果多酚的吸附量和吸附速率都高于X-5、HD400和NKA。所以最終選定AB-8為純化用大孔吸附樹脂。

圖1　不同樹脂對蘋果多酚的吸附效果

2.1.2不同濃度乙醇對解吸效果的影響

對于蘋果多酚的解吸，從解吸能力、易于回收、節(jié)能、廉價和毒性角度來選擇適宜的解吸劑，綜合考慮，以醇類較佳。本研究選用乙醇作為解吸劑，通過靜態(tài)實驗來確定乙醇濃度。取充分吸附蘋果多酚后的AB-8樹脂1.0g，分別準確加入30％、50％、70％、80％、90％乙醇各25mL，室溫靜置24h，過濾，檢測濾液中蘋果多酚的含量，根據(jù)濾液中多酚含量計算乙醇解吸能力，比較乙醇濃度對蘋果多酚解吸效果的影響，結(jié)果見表2。由表2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，樹脂的吸附能力越大，當乙醇濃度大于70％時，樹脂吸附能力增幅不是很大，同時乙醇濃度越大，乙醇越容易蒸發(fā)，有安全隱患，因此本實驗選用70％乙醇作為解吸劑，此時解吸率為85.68％。

表2　不同乙醇濃度對蘋果多酚的解析效果

2.1.3溫度對吸附性能的影響

準確稱取經(jīng)預處理的AB-8樹脂5.0g，置于150mL三角瓶中，加入濃度為0.866mg/mL的蘋果渣提取液50mL，靜置4h，吸附溫度分別設定為20℃、30℃、40℃和50℃，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，溫度對吸附性能的影響很小，溫度30℃時吸附能力只比20℃提高5％，考慮到節(jié)能，故在室溫下進行吸附即可。

圖2　溫度對吸附效果的影響

2.2AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)純化蘋果多酚工藝

稱取2.0g預處理好的AB-8樹脂，裝入2.0×40cm的玻璃層析柱中。將0.866mg/mL濃度的樣品放入樹脂，分段收集樣品，當流出液濃度達上樣的1/5時，可認為蘋果多酚已收集結(jié)束，停止進樣，計算吸附量。

2.2.1粗提液濃度對樹脂吸附能力的影響

粗提的蘋果多酚，添加不同質(zhì)量的蒸餾水，進行動態(tài)樹脂吸附實驗。若粗提液濃度小于0.5mg/mL，試驗過程中，樹脂容易泄漏，部分樹脂未能完成吸收，從而影響樹脂的吸附能力；濃度大于1.5mg/mL，溶液出現(xiàn)絮狀沉淀，使樹脂堵塞，吸附能力下降。由圖3可以看出，當濃度在1.1mg/mL時，樹脂的吸附能力最大。故上樣濃度控制在1.0mg/mL～1.3mg/mL范圍內(nèi)。

圖3　上樣濃度對吸附量的影響

2.2.2吸附流速對吸附能力的影響

研究不同吸附流速對樹脂吸附能力的影響，選擇流量分別為1、2、3、4BV/h，試驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，在1BV/h～4BV/h內(nèi)，隨著流速的增加，每毫升樹脂對蘋果多酚的吸附能力下降，但2BV/h較3BV/h、4BV/h下降速度慢，綜合考慮，本試驗選擇流速為2BV/h。

圖4　流速對吸附量的影響

2.2.3粗提液pH對樹脂吸附能力的影響

將粗提液用10％HCl和10％NaOH調(diào)節(jié)成不同pH值的溶液，進行動態(tài)吸附實驗，結(jié)果見圖5。由于多酚呈弱酸性，所以要達到較好的效果必須在弱酸性條件下進行吸附。當粗提液pH=4.80時，AB-8樹脂對蘋果多酚的吸附能力最強。在較高的pH（pH>4.80）條件下，酚羥基由于解吸而增加了其在水中的溶解度，從而降低了樹脂在水溶液中對多酚的吸附能力。而當pH<4.80時，部分黃酮類物質(zhì)改變性質(zhì)，樹脂吸附能力下降。因此，pH為4.80時，樹脂吸附能力較強。

圖5　pH對解吸效果的影響

2.2.4不同解吸速度對洗脫效果的影響

圖6　蘋果多酚解析曲線

選擇濃度為1.1mg/mL的粗提液，采用2BV/h的流速進行吸附，以5BV去離子水洗滌，然后用70％乙醇進行洗脫，解析流速采用1BV/h、2BV/h，分時段測定洗脫液中多酚的含量，制定解吸效果的曲線，結(jié)果見圖6。

解吸流速大小影響解吸效果，流速過快，解吸拖尾嚴重，洗脫帶寬，洗脫不徹底，效果差；流速過慢，解吸時間長，蘋果多酚易損失。常用的解吸流速是吸附流速的1/3～1/2，由圖6可以看出，不同流速對解吸能力是有一定的影響，以1BV/h的流速進行洗脫得到的峰形集中，2BV/h的流速洗脫則略有拖尾現(xiàn)象，故采用1BV/h的解吸流速，即為吸附流速的1/2，實驗結(jié)果表明解吸效果較為理想。經(jīng)過計算所得的蘋果多酚制品的純度由純化前的6.8％提高到15.5％。

2.3蘋果多酚的精制

經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的樣品仍含有較多糖類。采用SephadexG25可以對蘋果多酚進行進一步精制。SephadexG25屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)，適合于不同類型有機物的分離，并且性質(zhì)穩(wěn)定，易實施循環(huán)操作。

樣液上柱后用蒸餾水洗脫，流速1mL/min，每8min收集一次洗脫液，1～10為水洗液，10管后采用80％的乙醇以0.5mL/min的流速進行洗脫，每管按照0.5mL/min的量收集洗脫液，然后逐管分別進行多酚的測定，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看到，比較明顯的峰有6個，其中最早出現(xiàn)的峰多酚含量較少，自25管之后多酚的含量明顯增加，25～50管之間為多酚分布的高峰區(qū)間，合并25管之后的洗脫液進行組成測定。

圖7　SesphedexG25精制蘋果多酚的結(jié)果

2.4蘋果多酚的組成研究

將10種標準品，綠原酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、根皮苷、槲皮素、阿魏酸、對香豆酸、咖啡酸各取少量，用甲醇溶解后，混合稀釋至合適的濃度，按1.7中所述的色譜條件，以保留時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，做圖，標準品圖譜結(jié)果見圖8。

在蘋果渣中共檢測出5種多酚物質(zhì)，分別是綠原酸、表兒茶素、兒茶素、對香豆酸和根皮苷，見圖9（1、表兒茶素，2、綠原酸，3、兒茶素，4、對香豆酸，5、根皮苷）。從蘋果多酚物質(zhì)組成及比例上看，綠原酸含量最高，約占多酚物質(zhì)的85％，其它如兒茶素、對香豆酸、根皮苷等含量較低。精制后的蘋果多酚，經(jīng)冷凍干燥，得到產(chǎn)品蘋果多酚粉末。經(jīng)過計算所得蘋果多酚得率為0.12％，蘋果多酚的含量由初步純化的15.5％提高到75.6％。

圖8　標準品圖譜

圖9　蘋果多酚圖譜

3　結(jié)論

本研究選用AB-8大孔吸附樹脂進行蘋果多酚的柱層析純化，采用2BV/h吸附流速，1BV/h的解吸流速，可將蘋果多酚較好的洗脫下來。大孔樹脂純化后的蘋果多酚經(jīng)Sephadex精制得到純度較高的多酚產(chǎn)品。此時，蘋果多酚總酚得率為0.12％，含量為75.60％。

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The Research of Column Chromatography Separation of Apple Polyphenols in Apple Rvesidue

GE Bang-guo SONGYe
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation ofSupply&MarketingCo-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Research the purification of apple polyphenols from apple residue by macroporous adsorption resin,sephadex purification process parameters of apple polyphenols,select AB-8 for purification with macroporous adsorption resin,use 70％ethanol as a desorption agent.Apple polyphenols after purification by Sephadex,after freeze drying,get apple polyphenol powder,yield is 0.12％,content increased from 15.5％to 75.6％。

Key words:Apple polyphenols;macroporous resin;purification;refined

作者簡介：葛邦國（1978—），男，碩士，高級工程師，研究方向為果蔬精深加工

基金項目：國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2010GB24420688）

收稿日期：2015-09-01

中圖分類號：TS255.3

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1038(2016)02-0020-05