萬春鵬周油涌陳金印

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省果蔬保鮮與無損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045；2.江西柚色天香農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，江西上饒334606）

?

UPLC-QTOF-MS技術(shù)分析馬家柚果肉成分

萬春鵬1周油涌2陳金印1

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省果蔬保鮮與無損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045；2.江西柚色天香農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，江西上饒334606）

摘要：本文采用超高壓液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-DAD-QTOF-MS）對(duì)馬家柚果肉中的化學(xué)成分進(jìn)行分析。采用反相Agilent C18（50mm×2.1mm，1.8μm）色譜柱，甲醇與水（含0.1％甲酸）二元線性梯度洗脫，檢測(cè)波長340nm，流速0.25mL/min，柱溫25℃；以6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。通過得到的樣品電噴霧-質(zhì)譜（ESI-MS）負(fù)離子掃描模式下的準(zhǔn)分子離子峰、碎片信息（Product ions）、保留時(shí)間（TR）、紫外色譜圖（λmax nm）等信息，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)11種化學(xué)成分進(jìn)行初步解析，推測(cè)為（1）檸檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸櫞苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆樹甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。其中柚皮苷為馬家柚中主要的黃酮苷類成分。

關(guān)鍵詞：馬家柚；化學(xué)成分；UPLC-QTOF-MS

馬家柚是產(chǎn)于江西省廣豐縣境內(nèi)的一個(gè)紅心柚品種，是當(dāng)?shù)氐囊环N特色產(chǎn)品，具有果大、形美、耐儲(chǔ)運(yùn)、果肉細(xì)嫩、色澤淺紅、甜度適中以及出汁率高等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“江西省酸柚類第一名”的榮譽(yù)稱號(hào)[1]。馬家柚種植歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)、保健功能成分含量高，是一種高檔的保健柚。

馬家柚全身上下都是寶，柚皮可以入藥，具有消食和胃、理氣、化痰、解酒毒等功效，還可以加工成休閑食品；果肉可以鮮食，還可以加工成果汁、果酒等；柚子花因其有類似茉莉花的香味可以制作成花茶；柚子核含有豐富的檸檬苦素類化合物，具有一定的抗癌、抗病毒及其它有益生物活性。柚果肉中主要含有以β-檸檬烯為主的揮發(fā)性香氣成分[2]、以柚皮苷為主的黃酮類活性成分[3]。

然而，目前對(duì)馬家柚的研究?jī)H限于栽培技術(shù)[4]、品質(zhì)[5]和采后貯藏保鮮[6]等方面，對(duì)其活性成分的研究還未見系統(tǒng)報(bào)道。為了闡明其保健功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文利用UPLC-DAD-QTOF-MS對(duì)馬家柚果肉提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。采用負(fù)離子掃描模式，由準(zhǔn)分子離子峰、碎片信息結(jié)合紫外特征吸收、色譜保留時(shí)間，通過查閱其它柚類成分研究相關(guān)報(bào)道文獻(xiàn)，初步鑒定了馬家柚果肉中11種化學(xué)成分，主要為黃酮糖苷類化合物，它們分別是：（1）檸檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸櫞苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆樹甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。UPLC-DAD-QTOF-MS技術(shù)可以用于快速鑒定馬家柚果肉中的化學(xué)成分。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

馬家柚，2014年12月采自江西省廣豐縣，2015年3月由江西柚色天香農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。

甲醇，色譜純，德國默克。其余試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水為超純水，18.4MΩ·cm。濾膜，0.22μm，美國安捷倫公司。

1.2儀器與設(shè)備

UPLC 1290，美國Agilent公司；6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS，美國Agilent公司，配有G4212A紫外檢測(cè)器及電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）、Agilent C18色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm），二極管陣列（DAD）檢測(cè)器，Waters自動(dòng)進(jìn)樣器；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪；Mill-Q Advantage A10超純水儀，美國Millipore；榨汁機(jī)，美的WBL25B26。

1.3樣品的制備

馬家柚去皮，稱取2.0kg果肉用榨汁機(jī)絞碎后加2L甲醇浸泡提取5d，提取液過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，得到7.8g馬家柚甲醇提取物。稱取7.0g馬家柚甲醇提取物，溶解于100mL蒸餾水中，用等體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層溶液，旋干后冷凍干燥，得到4.2g萃取物，稱取0.5g萃取物溶解于10mL 50％甲醇，用0.22μm濾膜過濾，得馬家柚果肉樣品溶液，供UPLC-MS分析使用。

1.4UPLC-MS分離檢測(cè)條件

實(shí)驗(yàn)采用UPLC 1290超高效液相色譜系統(tǒng)，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長λ=340nm；使用Agilent UPLC1290，ZORBAX Eclipse Plus C18（RRHD）色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）用于優(yōu)化流動(dòng)相的條件，流動(dòng)相A為水（含0.1％甲酸），流動(dòng)相B為100％甲醇，二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相梯度設(shè)置為0～30min，5％B～100％B，流速為0.25mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣體積為2μL。

使用6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS，ESI源負(fù)離子模式下檢測(cè)，主要質(zhì)譜的工作參數(shù)如下：電噴霧ESI源MS全掃描和Target MS/MS負(fù)離子模式，霧化溫度為325℃。干燥氣N2流速為10L/min，霧化氣壓為30psig，離子掃描范圍為m/z50～1700。

2　結(jié)果與分析

圖1A（見下頁）為馬家柚提取物的UPLC-MS總離子流色譜圖，圖1B（見下頁）為340nm下的UPLC液相色譜圖，兩個(gè)色譜圖基本一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用UPLC-MS色譜分離條件，馬家柚提取物中的化學(xué)成分得到較好的分離。在超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)驗(yàn)中，馬家柚果肉提取物中的化學(xué)成分在負(fù)離子譜中豐度較大，主要出現(xiàn)[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，通過UPLC-MS負(fù)離子譜獲得色譜峰1～11對(duì)應(yīng)化合物的分子量，結(jié)合其它的碎片離子信號(hào)和相關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)道，推測(cè)馬家柚果肉化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。柚中黃酮類成分主要有三類結(jié)構(gòu)[7]，他們具有明顯的紫外吸收特征。（1）黃酮-O苷，其帶Ⅰ和帶Ⅱ紫外吸收為325和280nm左右；（2）黃酮-C苷，其帶Ⅰ和帶Ⅱ紫外吸收為340nm 和270nm左右；（3）黃酮醇-O苷，其帶Ⅰ和帶Ⅱ紫外吸收為355nm和260nm左右。

有機(jī)酸：柑橘中含有較高的有機(jī)酸，構(gòu)成其風(fēng)味物質(zhì)，有機(jī)酸主要有檸檬酸、奎寧酸和蘋果酸等，其中檸檬酸是柑橘果實(shí)中含量最高的有機(jī)酸，是決定果實(shí)品質(zhì)的重要因素之一。峰1（TR 2.38min），負(fù)離子譜中，m/z 191.0195豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰1分子量為192，結(jié)合其紫外吸收（λmax 205nm）為末端吸收，結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，另外其保留時(shí)間較短，這些都與柑橘中主要的有機(jī)酸檸檬酸較為一致[8]，推測(cè)峰1可能為檸檬酸。

圖1　馬家柚果肉化學(xué)成分UPLC-DAD-QTOF-MS總離子流(A)和液相色譜(B)圖

表1　馬家柚果肉11種化學(xué)成分

黃酮-O苷：是柚類果實(shí)中含量非常豐富的一類黃酮類次生代謝產(chǎn)物，其紫外吸收特征明顯，有兩個(gè)吸收峰，包括帶Ⅰ325nm和帶Ⅱ280nm左右。

峰2（TR 6.996min）負(fù)離子譜中，m/z為449.1081且豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰2分子量為450。其紫外吸收值顯示為特征黃酮類化合物的紫外吸收，碎片離子峰287.0555，表明峰2為黃酮糖苷，苷元分子量為288，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]從柚中鑒定的黃酮類成分，其可能為圣草素，柚中鑒定的黃酮糖苷多為7位糖基化，峰2推測(cè)為圣草素-7-O-葡萄糖甙。

峰4（TR 11.613min），負(fù)離子譜中，m/z595.1638豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰4分子量為596，碎片離子峰與峰2類似，分子量比峰2大146，推測(cè)為一個(gè)鼠李糖基，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]推測(cè)峰4為新圣草枸櫞苷，文獻(xiàn)報(bào)道廣西蜜柚、沙田柚和常山胡柚等均含有此化合物。

峰5（TR 12.908min），負(fù)離子譜中，m/z 433.1140豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰5分子量為434，碎片離子峰271.0613，表明峰5為黃酮糖苷，苷元分子量為272，檢索文獻(xiàn)[7]推測(cè)其為柚皮素，因此峰5為柚皮素-7-O-葡萄糖甙。

峰6（TR 13.174min），負(fù)離子譜中，m/z 579.1729豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰6分子量為580，碎片離子峰與峰5類似，分子量比峰5大146，推測(cè)為一個(gè)鼠李糖基，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道推測(cè)峰6為柚皮苷，另外，峰6為馬家柚中的主要化學(xué)成分。

峰7（TR 16.827min），負(fù)離子譜中，m/z 609.1792豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰7分子量為610，碎片離子峰301.2546，與橙皮素分子量相符，推測(cè)峰7為橙皮苷或新橙皮苷，但是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]柚果皮和果肉中的新橙皮苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于橙皮苷，因此推測(cè)峰7為新橙皮苷，具體結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步分離，通過NMR確定其結(jié)構(gòu)。

峰8（TR 17.326min），負(fù)離子譜中，m/z621.1807豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰8分子量為622，碎片離子峰271.0607與峰5和6類似，為柚皮素糖苷，分子量比峰6大42，可能為一乙酰基，根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道推測(cè)峰8為乙酰柚皮苷。

峰9（TR 18.023min），負(fù)離子譜中，m/z577.2248豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰9分子量為578，碎片離子峰269.3412和431.1564，表明峰9含有一個(gè)葡萄糖基和鼠李糖基，推測(cè)峰9為芹菜素-7-O-新橙皮糖苷，又名野漆樹甙，曾有文獻(xiàn)報(bào)道，其多存在于柑橘類的水果中[11]。

峰11（TR 30.312），負(fù)離子譜中，m/z271.2272豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰11分子量為272，峰11為峰5,6和8的苷元部分，推測(cè)峰11為柚皮素，柚皮素為柚子中含量較高的黃酮化合物[10]。

黃酮-C苷：也是一類黃酮類次生代謝產(chǎn)物，其紫外吸收表現(xiàn)為帶Ⅰ340nm和帶Ⅱ270nm左右。峰3(TR 11.214min)，負(fù)離子譜中，m/z 593.1468豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰3分子量為594，其紫外吸收顯示其為黃酮C苷類化合物[7]，根據(jù)文獻(xiàn)[7,9]，推測(cè)峰3為芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷。

黃酮醇-O苷：柚類果實(shí)中報(bào)道的此類化合物主要為山柰酚糖苷，其紫外吸收帶Ⅰ355nm和帶Ⅱ260nm左右。峰10（TR 19.119min），負(fù)離子譜中，m/z577.2263豐度最高，為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，表明峰10分子量為578，峰10和9為同分異構(gòu)體，但是峰10的紫外吸收顯示其為黃酮醇-O苷，且為山柰酚糖苷[12]，這也與碎片離子峰285.0392（山柰酚）相符，推測(cè)峰10為山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷。

3　結(jié)論

本研究建立了UPLC-DAD-QTOF-MS法鑒定馬家柚果肉中的黃酮類成分。UPLC-QTOF-MS具有分析時(shí)間短、效率高、靈敏度高、需要樣品量少等諸多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中草藥等植物次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定[13-15]。通過對(duì)柚果肉和果皮化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行檢索，了解柚中的化學(xué)成分種類，根據(jù)各化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分子量、液相色譜、保留時(shí)間和質(zhì)譜裂解規(guī)律，黃酮類化合物在負(fù)離子模式下可以得到[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，以及黃酮母核的碎片離子峰信號(hào)等信息，對(duì)11種化合物進(jìn)行解析，推測(cè)為（1）檸檬酸、（2）圣草素-7-O-葡萄糖甙、（3）芹菜素-6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、（4）新圣草枸櫞苷、（5）柚皮素-7-O-葡萄糖苷、（6）柚皮苷、（7）新橙皮苷、（8）乙酰柚皮苷、（9）野漆樹甙、（10）山柰酚7-O-鼠李糖3-O-鼠李糖苷和（11）柚皮素。其中柚皮苷為馬家柚中主要的黃酮苷類成分。

參考文獻(xiàn)：

[1]張為.江西國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品廣豐馬家柚[J].質(zhì)量探索,2012,9(7):15.

[2]朱岳麟,鄭曉梅,鄒卓,等.GC-MS法分析紅肉蜜柚果皮香精油的化學(xué)成分[J].廣東化工,2008,35(9):129-131.

[3]陳靜,高彥祥,吳偉莉,等.高效液相色譜法測(cè)定柑橘汁中的檸檬苦素和柚皮苷[J].色譜,2006,24(2):157-160.

[4]毛祥青,葉為波,施身兵,等.廣豐馬家柚優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,22(2):77-80.

[5]吳方方,楊海建,曹立新,等.授粉對(duì)廣豐馬家柚果實(shí)品質(zhì)的影響[J].中國南方果樹,2012,41(3):76-77.

[6]王齊發(fā),黃昌新,葉正旺.廣豐馬家柚采收與保鮮貯藏[J].現(xiàn)代園藝,2015,36(1):33.

[7]Zhang M,Duan C,Zang Y,et al.The flavonoid composition of flavedo and juice from the pummelo cultivar(Citrus grandis(L.) Osbeck)and the grapefruit cultivar(Citrus paradisi)from China[J]. Food Chemistry,2011,129(4):1530-1536.

[8]陳青英,陳俊偉,徐紅霞,等.大棚栽培‘玉環(huán)柚’果實(shí)發(fā)育與糖酸積累特性[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,30(5):492-497.

[9]Tripoli E,La Guardia M,Giammanco S,et al.Citrus flavonoids: Molecular structure,biological activity and nutritional properties:A review[J].Food Chemistry,2007,104(2):466-479.

[10]方波,趙其陽,席萬鵬,等.十種柚類及柚雜種果實(shí)中類黃酮含量的超高效液相色譜分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(9): 1892-1902.

[11]張?jiān)?周志欽,孫玉敬,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柑橘果實(shí)中18種類黃酮的含量[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(17): 3558-3565.

[12]Wan C,Yu Y,Zhou S,et al.Isolation and identification of phenoliccompoundsfromGynuradivaricataleaves[J]. PharmacognosyMagazine,2011,7(26):101-108.

[13]練杭蕓,梁乾德,馬增春,等.UPLC-QTOF-MS比較當(dāng)歸和川芎煎液化學(xué)成分差異[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(1):4-9.

[14]張亞中.基于超高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的白花蛇舌草注射液主成分分析[J].中草藥,2013,44(7):829-833.

UPLC-QTOF-MS Analysis of Constituents in the Pulp of Citrus maxima (Burm.)Merr.cv.Majia Yu

Wan Chun-peng1ZHOUYou-yong2CHENJin-yin1
(1.Jiangxi KeyLaboratoryfor Postharvest Technologyand Nondestructive Testing of Fruits&Vegetables,College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi Pomelo Color Fantasy of Agricultural Science and TechnologyDevelopment Company,Shangrao334606,China)

Abstract:Chemical Constituents in the pulp of C.maxima(Burm.)Merr.cv.Majia Yu were analyzed by UPLC-DADQTOF-MS method.Agilent C18（50mm×2.1mm,1.8μm）chromatographic column and the 6538 UHD Accurate-MS Q-TOF LC/MS spectrometer were used to analysis the extract sample,the other parameters of UPLC were as follows:methanol and water(containing 0.1％formic acid)gradient elution,detection wavelength was 340nm,the flow rate was 0.25mL/min, column temperature was 25℃.The ESI-MS anion quasi molecular ion peaks,product ions,the retention time,ultraviolet chromatogram were used to tentative identify the chemical constituents.Eleven chemical compositions were identified as (1)Citric acid,(2)Eriodictyol-7-O-glucoside,(3)Apigenin-6-C-glucose-7-O-glucoside,(4)Neoeriocitrin,(5)Naringenin-7-O-glucoside,(6)Naringin,(7)Neohesperidin,(8)Acetyl naringin,(9)Rhoifolin,(10)Kaempferol-7-O-rhamnose-3-O-rhamnoside and(11)Naringenin.Naringin was the main flavonoid glycosides in the pulp of C.maxima(Burm.)Merr.cv. Majia Yu.

Key words:Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Majia Yu;chemical Constituents;UPLC-QTOF-MS

作者簡(jiǎn)介：萬春鵬（1983—），男，博士，助理研究員，主要從事天然植物化學(xué)研究

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（111）；江西省“贛鄱英才555工程”（2012）

收稿日期：2015-10-08

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1038(2016)02-0028-04