王寧丁，劉曉秋，伍軍軍，陳 嘉，周錢糧，陳英杰，張永斌△

(1．廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 510405;2．廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所，廣州 510405; 3．廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 510405)

脾虛證糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型的建立及評價*

王寧丁1，劉曉秋2，伍軍軍1，陳 嘉1，周錢糧1，陳英杰3，張永斌1△

(1．廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 510405;2．廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所，廣州 510405; 3．廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 510405)

目的:建立帶有脾虛證的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型并對其進行評價。方法:采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)結(jié)合30%乙醇灌胃的方法建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，通過大鼠宏觀表征采集、血糖監(jiān)測、抓力測定、曠場實驗、爪和尾的RGB值等進行脾虛證的診斷及考證。結(jié)果:第4～10周模型組大鼠持續(xù)消瘦，拉力測定值降低，曠場活動減弱，舌質(zhì)變淡，爪和尾的r值降低，排便次數(shù)增加，糞便變軟或便溏，83%的模型動物出現(xiàn)糖尿病疾病特征、氣虛證1項和脾的組織定位體征1項以上指征。結(jié)論:腹腔注射STZ結(jié)合30%乙醇灌胃的方法成功建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，并發(fā)現(xiàn)建模后第4～10周可能為糖尿病大鼠脾虛證的時間窗。

糖尿病大鼠;胃黏膜損傷;脾虛證;動物模型

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和癌癥的世界第三重大疾?。?］，糖尿病并發(fā)癥是決定糖尿病患者預后的最主要因素，已成為世界性難題。DM屬于中醫(yī)消渴病范疇，近現(xiàn)代大量研究表明［2-4］，脾虛乃糖尿病的發(fā)病之本，也是糖尿病的中醫(yī)病機，而DM胃腸病變是其最常見的并發(fā)癥之一。為規(guī)范1型糖尿病胃黏膜損傷模型建立，并對病證結(jié)合動物模型進行研究，本實驗采用STZ腹腔注射加30%乙醇灌胃的方法，誘發(fā)1型糖尿病動物胃黏膜損傷模型，動態(tài)觀察動物臨床癥狀、血糖、體質(zhì)量等，并根據(jù)中醫(yī)理論模擬臨床望、聞、問、切和辨證方法，對糖尿病大鼠的宏觀表征和行為學變化進行評價，確定糖尿病大鼠脾虛證出現(xiàn)的時間窗，為病證結(jié)合研究并指導臨床用藥提供實驗性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

雄性SPF級SD大鼠73只，體質(zhì)量260～280 g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心(動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2008-0020)。STZ(Sigma公司)、穩(wěn)毫型血糖試紙(強生上海醫(yī)療器材公司)、檸檬酸(廣州醫(yī)藥站化學試劑綜合公司)、檸檬酸三鈉(成都化學試劑廠)。

1.2 分組及造模

SD大鼠造模前測體質(zhì)量和血糖，經(jīng)禁食不禁水12 h后按隨機數(shù)字表法分為正常組(29只)和模型組(44只)。模型組動物腹腔注射1%STZ溶液(用0.1 mol/L，pH4.2的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成10 g/L的溶液)，劑量5.5 ml/kg，正常組大鼠腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液5.5 ml/kg。注射STZ 72 h后監(jiān)測隨機血糖，連續(xù)3次血糖值≥16.8 mmol/L，且有多飲、多尿、多食癥狀入選糖尿病動物模型。造模同時每周大鼠灌胃30%乙醇1次，劑量10 ml/kg，連續(xù)4周。觀察16周動態(tài)采集糖尿病大鼠的宏觀表征，第16周末取胃組織做病理切片，HE染色觀察其病理變化。

1.3 體質(zhì)量、攝食量、飲水量和尿量

每周稱量動物體質(zhì)量，每月2組動物各取6只做代謝籠監(jiān)測，記錄動物24 h飲水量、食料量和尿量。體質(zhì)量用以判斷其陰盛衰度，食量用以判斷脾胃、胃氣及相關(guān)病證，飲水量用以判斷寒熱、陰陽及相關(guān)病證，每2周測量1次，連續(xù)16周。

1.4 計算爪、尾RGB值

在相同光照下，相機放大3倍拍攝大鼠左后爪和尾，記錄爪、尾詳細外觀及紅色程度，相片用PhotoShop7.0圖像軟件進行圖像處理，選取爪的掌部和尾中部作為RGB色度的定量分析，R代表紅色，G代表綠色，B代表藍色，計算出反映爪和尾紅色程度r值，r=R/(R+G+B)，每2周拍攝1次，連續(xù)16周。

1.5 抓力測定實驗

毛巾放置在平臺上并與電子拉力計相連，將大鼠放置毛巾上并向后拉，大鼠前肢由于本能反應(yīng)會抓住毛巾，前爪松開毛巾時的拉力即大鼠的最大抓力。抓力值用于判斷氣盛衰度，每2周測量1次，連續(xù)16周。

1.6 曠場試驗

本實驗所用敞箱為立方形，高40 cm，長寬均為50 cm，底面分成面積相等的25塊。以大鼠穿越的格子數(shù)作為水平活動得分，動物穿越1格為1次，如動物沿線行走每10 cm為1次。以直立次數(shù)為垂直活動得分，雙前肢離地為1次。每只動物測試1次，每次3 min。敞箱測試中的水平活動得分反映大鼠的活動度，垂直活動得分反映大鼠對周圍事物的興趣高低，每2周測量1次，連續(xù)16周。

1.7 脾虛證判定標準

參考1987年衛(wèi)生部藥政局頒布的《中藥治療脾虛證的臨床研究指導原則》和湯家銘主編的《醫(yī)學實驗動物學》，從大鼠的表征推斷脾虛證證候疾病診斷依據(jù):隨機血糖≥16.8 mmol/L;證候診斷依據(jù):氣虛證如乏力、疲倦、活動減少、曠場活動減弱和舌胖大邊有齒痕等;脾的組織定位體征如乏力、懶動、肌體萎軟不用、消瘦、枯槁無澤、食欲不振、大便異常、腹部脹滿、肛門污穢等。動物模型具備:疾病診斷依據(jù)+氣虛證1項+脾的組織定位體征1項以上即可。

1.8 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動物建模情況

表1、2顯示，模型組大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿且體型消瘦的“三多一少”特征，30%乙醇灌胃4周后，模型動物糞便逐漸變稀、肛周污穢。結(jié)合血糖監(jiān)測結(jié)果顯示，已建立較穩(wěn)定的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。觀察到第4周時，糖尿病模型的成模率為75%，基本與文獻報道相近。觀察至第16周時，糖尿病胃腸損傷模型的成模率為61.4%。

表1 2組大鼠血糖、體質(zhì)量、食量、飲水量和尿量比較

表2 SD大鼠成模率與死亡率(只)

2.2 爪和尾的RGB值

表3顯示，正常組大鼠舌質(zhì)淡紅，略暗潤澤，反映大鼠紅色度的r值處于正常范圍;模型組大鼠舌質(zhì)偏淡，舌胖大邊有齒痕，爪略顯干，尾顯蒼白，r值從第4周起明顯降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 抓力測定結(jié)果

表3顯示，正常組大鼠抓力隨日齡增加而有所變化，但變化比較平緩;模型組動物注射STZ后開始消瘦、蜷縮，第4周起抓力明顯小于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.4 曠場實驗結(jié)果

表3顯示，正常組大鼠活動正常，模型組動物第4周后在曠場實驗箱里縮懶動，對周圍事物興趣度降低，穿格次數(shù)與直立次數(shù)均少于正常組，第4周、第6周差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，P＜0.01)。

表3 2組大鼠抓力、爪及尾RGB值和曠場試驗結(jié)果

2.5 大鼠胃黏膜病理染色結(jié)果

圖1顯示，正常組大鼠胃黏膜上皮細胞連續(xù)性好，黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，黏膜肌層和黏膜下層未見毛細血管擴張瘀血。模型組大鼠胃黏膜層上皮細胞黏液變薄、缺失、細胞間隙變大，有輕度的壞死，胞漿有空泡變形成，毛細血管可見有擴張和炎細胞浸潤。

圖1 2組大鼠胃黏膜病理組織圖(HE染色×100)

2.6 初步確定糖尿病大鼠脾虛證時間窗

模型組大鼠腹腔注射STZ 72 h后，隨機血糖普遍升高并出現(xiàn)糖尿病疾病特征，第2周起部分模型大鼠開始消瘦，活動減少，體質(zhì)量下降，毛色枯槁無澤，排便次數(shù)增加;第4～10周模型組大鼠持續(xù)消瘦，拉力測定值降低，曠場活動減弱，舌質(zhì)變淡，爪和尾的r值降低，排便次數(shù)增加，糞便變軟或便溏，83%的模型動物出現(xiàn)糖尿病特征、氣虛證1項和脾的組織定位體征1項以上指征，初步辨證為脾虛證，因此腹腔注射STZ后第4～16周應(yīng)為糖尿病大鼠脾虛證的時間窗。

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇。中醫(yī)的證是臨床生理或病理變化的客觀反映，其生理或病理變化是可以通過實驗指標來表達的。目前多數(shù)病證結(jié)合模型的造模及評價方法將證候和疾病人為分開，兩套方法、兩種標準整合在同一動物上。雖然這種評價方法是現(xiàn)在最常用也是有一定根據(jù)和理論支撐的，但這種方法常常是證候指標和病理指標的簡單相加，將病證結(jié)合模型中證候和疾病的關(guān)聯(lián)性忽視了。尋找中醫(yī)證候與疾病病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)性大的檢測指標，將有利于中醫(yī)證候的客觀化。如馮博等［5］探討了胰升血糖素樣肽-1(GLP-1)與糖尿病脾虛證的關(guān)系;龔燕冰等［6］總結(jié)了內(nèi)皮素、脂質(zhì)、免疫系統(tǒng)、性激素、垂體-腎上腺軸激素、NO、酪氨酸蛋白激酶(Ins-RTPK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞素-6(IL-6)等與糖尿病證候的關(guān)系，但中醫(yī)證候本身的復雜性決定了證候與客觀指標之間不可能存在線性關(guān)系，該類研究存在一定的局限性。

本研究在“有病便是有證”思想指導下，在未疊加其他證候造模因素條件下，利用STZ誘發(fā)雄性SD大鼠脾虛證1型糖尿病模型，并結(jié)合30%乙醇灌胃促進糖尿病大鼠胃黏膜損傷的發(fā)生，利用現(xiàn)代醫(yī)學評價方法，計量化中醫(yī)四診信息并做統(tǒng)計學處理，篩選出穩(wěn)定的疾病動物模型，分別進行基本宏觀表征、特性宏觀表征的動態(tài)采集及行為學實驗檢測;臨床癥狀與動物表征的等效轉(zhuǎn)化并做證候?qū)傩宰R別;微觀理化指標病理切片檢測、確定了1型糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型脾虛證的時間窗。該項研究體現(xiàn)了中醫(yī)思想并為糖尿病動物模型和中醫(yī)證候研究提供了一定的背景資料。

［1］田婷，馬向華，沈捷．2型糖尿病動物模型研究概況［J］．醫(yī)學綜述，2011(6):905-908．

［2］潘善余．糖尿病從脾論治探討［J］．浙江中醫(yī)雜志，2004，39 (1):6-7．

［3］陳長青，熊曼琪，李賽美．消渴病(糖尿病)的病機研究進展［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2002(10):72-74．

［4］賀文廣，楊競，鐘麗紅．楊競從脾論治糖尿病的經(jīng)驗［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2005，39(3):27-28．

［5］馮博，孫豐雷，徐學敏．淺探胰升血糖素樣肽-1水平與糖尿病脾虛證的關(guān)系［J］．江蘇中醫(yī)藥，2012(11):7-9．

［6］龔燕冰，高思華，倪青．糖尿病中醫(yī)證候的微觀機制探析［J］．中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(5):94-96．

Establishment and evaluation of gastric mucosal damage model in diabetic rats with spleen deficiency syndrome

WANG Ning-ding1，LIU Xiao-qiu2，WU Jun-jun1，CHEN Jia1，ZHOU Qian-liang1，CHEN Ying-jie3，ZHANG Yong-bin1△
(1．Laboratory Animal Research Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2．Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 3．First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

Objective:The research aimed to observe and evalute the damage model of gastric mocosa in diabetic rats with spleen deficiency．Method:The damage model of gastric mucosa in diabetic rat produced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in combination with 30%ethanol．Through macroscopic characterization of acquisition in rats，blood sugar monitoring，holding power measurement，open-field test and the claws and tail of the RGB values to diagnosis and evaluate spleen-deficiency syndrome．Result:Observed 4thto 10thweeks，the study found that rats in model group continuous thin，tension values were lower，open-field activities were weaken，tongue nature turn light，the RGB values of claws and tail were lower，increase of the times．of stool and change to soft or loose，and 83%of the animal model appeared diabetes disease characteristics，one deficiency syndrome，and the organization of the spleen positioning signs 1 or more indications．Conclusion:The damage model of diabetic rat gastric mucosa could be successfully induced by intraperitoneal injection method of STZ in combination with ethanol，and the time window for the appearance of spleen deficiency was 4-10 weeks．

diabetic rat gastric mucosal injury;Spleen deficiency syndrome; Animal model

R-587．1

A

1006-3250(2016)01-0038-03

2015-02-20

廣東省科技計劃資助項目(2010B060500013，2011B060300007);國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310572021)

王寧丁(1990-)，女，醫(yī)學碩士，從事人類疾病模型建立及藥效的臨床與研究。

△通訊作者:張永斌，男，副研究員，醫(yī)學博士，E-mail:zyb-73 @163．com。