劉如秀，周晟芳，李 慧，關(guān)宣可，尹琳琳，羅何維，劉金鳳

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

滋腎活血方對冠心病心肌缺血腎虛血瘀型大鼠外周血漿中ET、NO及IL-18含量的影響*

劉如秀，周晟芳，李 慧，關(guān)宣可，尹琳琳，羅何維，劉金鳳

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

目的:觀察滋腎活血方對冠心病心肌缺血腎虛血瘀型大鼠外周血漿中內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)及白介素(IL)-18含量的影響，以探索該藥的作用機制。方法:將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分成空白對照組、模型組、小劑量組、中劑量組、大劑量組5組各12只。采用“結(jié)扎左冠狀動脈前降支+注射氫化可的松法”造模。造模后給藥各組分別給予不同劑量滋腎活血方藥液，連續(xù)灌胃7 d記錄心電圖，腹主動脈取血檢測ET、NO及IL-18含量。結(jié)果:滋腎活血方可以預(yù)防腎虛血瘀模型大鼠缺血心肌壞死性Q波產(chǎn)生，減輕心肌損傷，并能降低血漿中ET及IL-18含量，升高NO水平。結(jié)論:滋腎活血方對冠心病心肌缺血腎虛血瘀型大鼠心電圖所示的心肌缺血有改善作用，其可通過抗炎、穩(wěn)定動脈斑塊、減輕心肌缺血程度，從而達到改善腎虛血瘀證冠心病心肌缺血的作用。

滋腎活血方;心肌缺血;內(nèi)皮素;一氧化氮;白介素-18

冠狀動脈缺血性心臟病是冠狀動脈粥樣硬化引起心肌供血不足所致的心臟病，是心血管系統(tǒng)的常見多發(fā)病，臨床以胸痛等一系列心肌缺血表現(xiàn)為主，目前已成為影響人類健康的重大疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1-2］。臨床和基礎(chǔ)研究表明，冠狀動脈缺血性心臟病患者以腎虛血瘀證多見。前期臨床研究證實，國醫(yī)大師劉志明創(chuàng)立的滋腎活血方治療本病療效確切［3-4］。本研究通過制備心肌缺血腎虛血瘀模型大鼠，觀察滋腎活血方對其心電圖的影響，并通過檢測血漿中代表性斑塊形成因子內(nèi)皮素(Endothelin，ET)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)及炎癥因子白介素18(Interleukin 18，IL-18)含量的改變，探索滋腎活血方治療冠心病心肌缺血腎虛血瘀證的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±20)g，由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供(許可證號SCXK(京)2012-0001)。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPFII級動物房，飲用純凈水，飼以合格大鼠飼料，相對濕度45%～70%，環(huán)境溫度18℃～22℃。

1.2 主要試劑與藥物

滋腎活血方藥液由廣安門醫(yī)院大興制劑中心制備，制備時投入生藥3kg(首烏、栝樓、三七等)，出藥液3 L，含生藥量1 g/ml。戊巴比妥鈉由上海艾研生物有限公司提供，鹽酸利多卡因注射液由北京益民藥業(yè)有限公司提供;注射用青霉素鈉由華北制藥股份有限公司提供，大鼠ET、IL-18、NO試劑盒由上海滬宇生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 造模方法

用“左冠狀動脈前降支結(jié)扎方法聯(lián)合注射氫化可的松法”制備冠心病心肌缺血腎虛血瘀病證結(jié)合模型［5-6］。具體步驟如下:①開放氣道:按0.4 ml/ 100 g腹腔注射濃度1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，行氣管插管，連接呼吸機(設(shè)置參數(shù):呼吸比1∶2，潮氣量3 ml/kg，呼吸頻率80次/min);②結(jié)扎手術(shù):逐層開胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈前降支(從左心耳下邊緣入針，肺動圓錐處下1 mm出針);③觀察縫合:觀察心電圖，如II和V2導(dǎo)聯(lián)顯示出以下任一圖形特點即為造模成功:ST段弓背向上，J點抬高1.5 mv;T波低平(50%)、雙向、倒置;ST段下移0.5 mv。成功制備左前降支梗死缺血模型后縫合，蘇醒后拔氣管插管;給予20萬U青霉素抗感染治療3 d。皮下注射氫化可的松注射液3.7 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 動物分組與給藥方法

60只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、大劑量組、中劑量組和小劑量組5組各12只。造模后，模型組、小劑量組、空白對照組各死亡3只，大劑量組死亡4只，中劑量組死亡5只。

青霉素治療3 d后，于第4天開始灌胃給藥。大劑量組每日以生藥量21.6 g/kg灌服滋腎活血方藥液;中劑量組每日以生藥量10.8 g/kg灌胃;小劑量組每日以生藥量5.4 g/kg灌胃?？瞻讓φ战M和模型組給予等量純凈水，連續(xù)灌胃7 d。

2.3 取材與指標檢測方法

灌胃后第7天連接多導(dǎo)聯(lián)心電圖記錄儀描記心電圖，隨后腹主動脈取血，置于抗凝管，4℃，3000 r/ min離心20 min，取上清(血漿)－20℃保存。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附方法，參照試劑盒說明書檢測各組大鼠血漿中ET、NO及IL-18含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 冠脈結(jié)扎手術(shù)對模型大鼠心電圖的影響

圖1顯示，術(shù)前大鼠心電圖未見心律失常，II、V2導(dǎo)聯(lián)QRS波群呈Rs波形，無異常Q波，ST段無抬高或壓低等。術(shù)后大鼠心電圖出現(xiàn)明顯缺血改變，II、V2導(dǎo)聯(lián)QRS波群與抬高的ST段融合，II導(dǎo)聯(lián)表現(xiàn)為“M”形，V2導(dǎo)聯(lián)為紅旗形，提示冠脈結(jié)扎手術(shù)成功，心肌缺血模型制備完成。

圖1 冠脈結(jié)扎手術(shù)對模型大鼠心電圖的影響

3.2 滋腎活血方對冠心病心肌缺血腎虛血瘀模型大鼠心電圖的影響

取材前采集心電圖，比較空白對照組，模型組出現(xiàn)明顯心肌缺血壞死，II、V2導(dǎo)聯(lián)均出現(xiàn)壞死性Q波，II導(dǎo)聯(lián)QRS波群呈QS波形，V2導(dǎo)聯(lián)呈QS波形，ST段壓低明顯。與模型組比較，大劑量組與正常組接近，未見異常Q波，II導(dǎo)聯(lián)正常，QRS波群呈Rs波形，ST段無抬高或壓低，V2導(dǎo)聯(lián)QRS波群呈RS形，T波略低平;中劑量組無壞死性Q波，但仍有缺血表現(xiàn)，II導(dǎo)聯(lián) QRS波群呈Rs波形，V2導(dǎo)聯(lián)QRS波群呈R波形，ST段與R波融合呈紅旗形，T波低平;小劑量組心肌壞死缺血表現(xiàn)減少，II導(dǎo)聯(lián)QRS波群呈Rs波形，V2導(dǎo)聯(lián)存在壞死形Q波，QRS波群呈QS波形，ST段均存在明顯壓低。圖2顯示，隨著藥物劑量加大，心肌缺血損傷逐漸減輕，心肌壞死發(fā)生率明顯降低。

圖2 滋腎活血方對各組大鼠心電圖的影響

3.3 滋腎活血方對冠心病心肌缺血腎虛血瘀型大鼠外周血漿ET、NO、IL-18含量的影響

與空白對照組比較，模型組ET含量顯著升高(P＜0.01)。給予大、中、小劑量滋腎活血方灌胃后，均可以不同程度降低血漿ET濃度，大劑量、中劑量與模型組比較，ET含量均顯著性下降(P＜0.01)。3組之間比較，隨著給藥濃度增加血漿ET濃度有所降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

與空白對照組比較，模型組血漿NO濃度顯著降低(P＜0.01)。比較模型組，給予不同劑量滋腎活血方灌胃后，均不同程度升高血漿NO濃度(P＜0.01，P＜0.05)。大劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。大劑量組與中、小劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1顯示，模型組血漿IL-18含量與空白對照組比較顯著增加(P＜0.01)。灌胃大、中、小劑量滋腎活血方后均可不同程度降低血漿IL-18含量，大劑量與模型組比較IL-18含量顯著減少(P＜0.01)，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中、小劑量相對于模型組IL-18含量明顯下降(P＜0.05)。3組之間比較，隨著給藥濃度增加，血漿IL-18濃度降低，中、小劑量組相對大劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，中、小劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 5組大鼠外周血漿ET、NO、IL-18含量變化(±s，℃)

注:與空白對照組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與大劑量組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與中劑量組比較:▲▲P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 血漿內(nèi)皮素濃度 血漿白介素18濃度 血漿一氧化氮濃度空白對照組9 30．16±0．51 63．88±3．25 57．09±3．57模 型 組 9 54．92±2．88△△ 85．23±12．27△△ 41．76±10．46△△大劑量組 8 44．75±2．33＊＊△△## 65．26±4．98＊＊## 56．90±2．92＊＊#中劑量組 7 48．50±2．15＊＊△△▲▲ 71．55±2．30＊△△ 52．45±2．60＊△△小劑量組 9 52．82±3．25△△ 73．18±5．65＊△△ 51．56±8．49＊△△

4 討論

冠心病主要表現(xiàn)為胸痛及由心肌缺血缺氧引起的其他癥狀，中醫(yī)證型以腎虛血瘀證居多。心電圖是診斷和判斷療效的常用檢查方法［7］，冠狀動脈痙攣或閉塞時，冠脈血流量驟減，在心電圖上表現(xiàn)為ST段和T波改變。經(jīng)研究證實，II導(dǎo)聯(lián)能較好地呈現(xiàn)冠狀動脈前降支心肌缺血狀態(tài)，故本實驗選用II、V2導(dǎo)聯(lián)記錄心電圖。結(jié)扎冠狀動脈前降支手術(shù)過程中可見II、V2導(dǎo)聯(lián)的QRS波群與抬高的ST段相融合，呈明顯的心肌缺血表現(xiàn)，證明心肌缺血模型制備成功。滋腎活血方不同劑量組與模型組比較均有不同程度改善，且藥物劑量與心肌缺血改善為正相關(guān)關(guān)系。隨著劑量加大，壞死性Q波消失，ST段升高與T波壓低程度明顯減少，其中高劑量組與空白對照組較接近，說明運用滋腎活血方能緩解冠脈痙攣、擴張冠脈、降低心肌氧耗從而改善心肌功能，達到抗心肌缺血、防止心肌損傷的作用。

ET是由內(nèi)皮細胞合成的環(huán)形多肽類血管活性物質(zhì)，是內(nèi)源性收縮因子中最強的長效血管收縮劑之一，有強大的促血管平滑肌細胞增殖、收縮心肌和血管作用，能誘發(fā)動脈硬化及斑塊形成，對維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)有重要作用［8］。IL-18由巨噬細胞、T淋巴細胞等多種細胞產(chǎn)生，可促使心肌細胞釋放黏附因子和炎癥遞質(zhì)，通過誘導(dǎo)干擾素γ產(chǎn)生激活巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞發(fā)生炎性反應(yīng)［9-10］，是冠心病發(fā)生發(fā)展的危險因素，其高度表達與斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān)關(guān)系，是獨立預(yù)測致死性心血管事件的因子［11-12］。NO是一種由內(nèi)皮細胞合成并釋放的舒血管因子，能夠保持冠脈動態(tài)平衡，維持正常心肌的供血，對缺血后心肌有較好保護作用，是調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的重要血管活性物質(zhì)［13］。實驗結(jié)果表明，滋腎活血方能降低冠心病心肌缺血腎虛血瘀模型大鼠血漿中ET、IL-18含量，且隨著給藥濃度的增高，下降趨勢更加明顯;此方對促進NO的合成有積極作用，說明滋腎活血方通過抑制血管過度收縮及炎性反應(yīng)、舒張血管，達到保護心血管，防止心肌缺血的作用。

滋腎活血方是國醫(yī)大師劉志明治療冠心病的原創(chuàng)方，亦是廣安門醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，前期大量研究已證明了該方的安全性及有效性［4，14］。劉志明認為冠心病多為虛實夾雜，患者多有體質(zhì)本虛和久病傷正的特點，獨用祛瘀化濁通痹難獲良效，須兼以扶正。全方配伍通補兼施，扶正祛邪并用，方由栝樓、薤白、三七、桑椹、制首烏等組成。腎為五臟之根、先天之本，如稟賦素弱或無規(guī)律作息日久均累及腎。心火居上，腎水居下，心腎交通，水升火降，則水火相濟，病無以生;若陰陽失衡、水火不濟則疾病叢生。劉老認為扶正首當滋腎固腎，多數(shù)冠心病心肌缺血患者存在心腎同病狀態(tài)，心腎同治可獲良效。本研究證實，通過比較各組心電圖發(fā)現(xiàn)滋腎活血方能有效阻止心肌損傷壞死，減輕心肌缺血癥狀;通過觀察ET、IL-18、NO指標發(fā)現(xiàn)，滋腎活血方能抑制血管活性因子釋放，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而擴張冠脈減少心肌缺血發(fā)生，為闡明滋腎活血方的作用機理提供依據(jù)。

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Effect of Ischemic Myocardium in Coronary Heart Disease Rats with Kidney Deficiency and Blood Stasis on IL-18，NO and ET by Using ZiShen HuoXue Recipe

LIU Ru-xiu，ZHOU Sheng-fang，LI Hui，GUAN Xuan-ke，YIN Lin-lin，LUO He-wei，LIU Jin-feng
(Guanganmen hospital，China academy of Chinese medicine science，Beijing 100053，China)

Objective To observe the changes of ET，NO and IL-18 in plasma of myocardial ischemia rats with kidney deficiency and blood stasis syndrome，explore the mechanism of this disease which is cured by ZiShen HuoXue recipe．Method Selected 60 healthy Wistar rats，the rats were randomly divided into control group、model group、small-dose group、middle-dose group and large-dose group．There are 12 rats in each group．Building the myocardial ischemia model rats with kidney deficiency and blood stasis by ligating the left anterior descending coronary artery and injecting the hydrocortisone．Small，medium and large dose groups were given 5.4g/kg/d，10.8g/kg/d，21.6g/kg/d ZiShen HuoXue recipe，blank control group and model group were treated with pure water．Respectively corresponding drug intervention 7 days，then get ECG before draw blood from abdominal aortic，check the levels of ET，NO and IL-18 by Elisa．Result ZiShen HuoXue recipe can prevent the Q wave from ischemia in rats with kidney deficiency and blood stasis model，reduce myocardial injury，and decrease the level of IL-18 and ET in plasma，and increase the level of NO．Conclusion:The appropriate amount of ZiShen HuoXue recipe could improve the ECG of myocardial ischemia model rats，and reduce the myocardial ischemia by anti inflammation and stable arterial plaque，and improve the effect of myocardial ischemia and blood stasis syndrome．

ZiShen HuoXue recipe;myocardial ischemia;ET;NO;IL-18

R285.5

B

1006-3250(2016)01-0054-03

2015-05-11

北京市自然科學(xué)基金資助項目(7122153)-名老中醫(yī)滋腎活血方對鼠缺血心肌蛋白組學(xué)及分子機理研究;北京中醫(yī)藥薪火傳承“3+3”工程項目(830104)-劉志明名老中醫(yī)工作室;中國中醫(yī)科學(xué)院“名醫(yī)名家傳承”項目(CM20141006)-劉志明學(xué)術(shù)思想與臨床經(jīng)驗傳承研究

劉如秀(1954-)，女，湖南人，主任醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的臨床與研究。