張 毅，李 娟，李金田，趙鯤鵬，張 弢，劉永琦，魏舒暢，蘇 韞，張明淵

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥藥理與毒理學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

芪蛭皺肺顆粒對(duì)COPD模型大鼠血?dú)夥治黾癐L-4細(xì)胞因子表達(dá)的影響*

張 毅，李 娟，李金田r，趙鯤鵬，張 弢，劉永琦，魏舒暢，蘇 韞，張明淵

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥藥理與毒理學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

目的:觀察芪蛭皺肺顆粒(QZZF)對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型血?dú)夥治黾胺闻莨嘞匆?BALF)、血清中IL-4表達(dá)的影響，探討其阻抑COPD的效應(yīng)及其機(jī)制。方法:Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、蘇子降氣丸組、羅氟司特組與QZZF大、中、小劑量組，采用氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)加煙熏法復(fù)制COPD大鼠模型，造模后第15天開始藥物干預(yù)，第43天動(dòng)脈血?dú)夥治黾皺z測(cè)BALF、血清中IL-4的表達(dá)水平。結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠動(dòng)脈血pH、PaO2、SaO2降低，血清、BALF中IL-4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PaCO2、Hct降低不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒中、小劑量組動(dòng)脈血pH，芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組PaO2、SaO2顯著升高，而各個(gè)治療組血清IL-4升高，QZZF中劑量組BALF中IL-4升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:芪蛭皺肺顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)血清及BALF中IL-4表達(dá)水平，可能是通過(guò)減輕氣道炎癥浸潤(rùn)、提高肺通氣和肺換氣能力、糾正低氧血癥和高碳酸血癥，從而干預(yù)COPD的發(fā)生發(fā)展。

慢性阻塞性肺疾病;芪蛭皺肺顆粒;血?dú)夥治?白細(xì)胞介素4

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD)簡(jiǎn)稱慢阻肺，以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺對(duì)有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，可伴有氣道高反應(yīng)性［1］。前期研究表明，芪蛭皺肺顆粒可減輕COPD模型大鼠肺部炎癥反應(yīng)，改善COPD模型大鼠呼吸功能，干預(yù)COPD模型大鼠小氣道重塑等［2～4］。本文在前期研究基礎(chǔ)上，擬從肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、血清中白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)的表達(dá)及動(dòng)脈血?dú)夥治龅挠绊?，探討芪蛭皺肺顆粒阻抑COPD的效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量(200± 20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)SCXK(甘)2011-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證編號(hào) SCXK(甘)2011-0001-0001105)。

1.2 藥物

芪蛭皺肺顆粒由黃芪、水蛭、黨參等中藥組成，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥物制劑室制備;蘇子降氣丸由吉林紫鑫藥業(yè)生產(chǎn)(產(chǎn)品批號(hào)11040106102);羅氟司特由無(wú)錫泓興生物醫(yī)藥科技有限公司提供(產(chǎn)品批號(hào)20110905)。

1.3 主要試劑與儀器

脂多糖(LPS)購(gòu)自Sigma公司(L-2880)，IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司(201128)。戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司(批號(hào)090822);蘭州香煙，蘭州煙草公司 (批號(hào)104193502);Radiometer ABL80血?dú)夥治鰞x，丹麥雷度;Benchmark plus酶標(biāo)儀，BIO RAD公司。

1.4 分組與造模

SPF級(jí)Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、蘇子降氣丸組、羅氟司特組與芪蛭大、中、小劑量組各10只。COPD大鼠模型采用氣管內(nèi)滴注LPS加煙熏法復(fù)制［4］，分別于第1天和第14天氣管內(nèi)滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13天、第15～28天每日上午在容積為48 L玻璃密閉箱內(nèi)持續(xù)熏蘭州牌香煙霧30 min，每日1次，每只1支。

1.5 給藥

從造模第29天起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃干預(yù)治療，陽(yáng)性對(duì)照組灌服蘇子降氣丸(相當(dāng)原藥材1.08 g/ kg)、羅氟司特(0.045×10－3g/kg)，芪蛭小、中、大劑量組灌服芪蛭皺肺顆粒(相當(dāng)于原藥材0.54、1.08、2.16 g/kg)，每日上午灌胃1次，連續(xù)14 d。

1.6 大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量觀察

觀察各組大鼠活動(dòng)狀態(tài)、對(duì)外界反映的靈敏度、皮毛性狀、飲食情況、體質(zhì)量變化、死亡情況及大鼠咳嗽、氣喘、鼻及呼吸道分泌物、氣道痰鳴音等癥狀并詳細(xì)記錄。各組造模前和給藥前分別稱大鼠體質(zhì)量，給藥期間每周測(cè)體質(zhì)量1次，觀察變化并記錄數(shù)據(jù)。

1.7 血?dú)夥治鰴z測(cè)

第43天戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，股動(dòng)脈采血，立即采用丹麥 Radiometer ABL8型血?dú)夥治鰞x進(jìn)行分析。測(cè)定主要指標(biāo)包括血液酸堿度(pH)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、動(dòng)脈血氧飽和度(oxygen saturaton，SaO2)、動(dòng)脈血氧分壓(pa rtialpressu re of oxygen，PaO2)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit value，Hct)，剩余血液用于IL-4水平檢測(cè)。

1.8 大鼠血清中IL-4水平測(cè)定

將剩余血液4℃、3000 r/min離心10 min，制備血清，采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 大鼠肺泡灌洗液中IL-4的水平測(cè)定

采血后處死大鼠解剖出完整的肺和氣管，向左側(cè)肺葉注入0.9%生理鹽水3 ml，緩慢吸出重復(fù)2次，回收灌洗液(BALF)約為4 ml，用單層無(wú)菌紗布過(guò)濾以去除黏液，放入無(wú)菌離心管中，4℃、3000 r/ min離心10 min，取上清液約2 ml，采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況影響

第2次造模結(jié)束時(shí)(即第15天)，COPD模型組大鼠精神不振、活動(dòng)及食量明顯減少、反應(yīng)遲鈍、體瘦、皮毛稀疏、灰黃無(wú)光澤并有脫落，空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)好、飲食正常、活潑好動(dòng)、反應(yīng)靈敏、皮毛亮澤，其余各組情況介于兩者之間未見明顯不同。

造模各組大鼠于造模開始第1天即出現(xiàn)輕微呼吸急促，氣粗之后漸為慢性咳嗽、口鼻潮濕、分泌物較多，并出現(xiàn)食少、納呆、少動(dòng);第28天第2次造模結(jié)束時(shí)，COPD模型組大鼠開始出現(xiàn)氣喘，部分可聞及哮鳴音。各干預(yù)組大鼠經(jīng)灌胃治療后癥狀不同程度減輕，口鼻分泌物減少，進(jìn)食有增加，僅偶有咳嗽?？瞻讓?duì)照組大鼠無(wú)特殊表現(xiàn)。

2.2 對(duì)血?dú)夥治龅挠绊?/p>

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠動(dòng)脈血pH、PaO2、SaO2降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PaCO2、Hct降低不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒中、大劑量組動(dòng)脈血 pH、芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組PaO2、SaO2顯著升高，芪蛭皺肺顆粒中、小劑量組PaCO2減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓闆r(±s)

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓闆r(±s)

注:與空白組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較:●P＜0.05，●●P＜0.01

組別pH PaCO2(mmHg) PaO2(mmHg) SaO2(%) Hct(%)空 白 組模 型 組羅 氟 司 特 組蘇 子 降 氣 組QZZF小 劑 量 組QZZF中 劑 量 組QZZF大 劑 量 組7.40±0.05 7.31±0.13▲7.37±0.03 7.36±0.03 7.37±0.05 7.42±0.02●●7.39±0.03●43.33± 9.03 52.17±12.48 41.00± 2.45●43.50± 6.80 41.33± 8.09●37.50± 4.93●●46.67± 4.63 87.50± 9.85 62.33± 7.53▲▲82.00± 8.72●76.83±16.09●76.67± 9.77●82.50± 9.14●●83.50±18.62●●96.33±1.50 87.30±8.43▲▲95.56±1.13●●92.95±6.38●93.98±4.08●96.02±1.27●●95.23±2.60●●49.17± 3.97 47.67± 3.08 56.60±15.71●49.17± 8.75 52.67± 2.73 49.83± 2.79 49.40± 1.67

2.3 對(duì)血清及BALF中IL-4水平表達(dá)的影響

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清、BALF中IL-4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，各治療組血清中IL-4降低，芪蛭皺肺顆粒中劑量組BALF中IL-4降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

COPD特征性的病理生理變化時(shí)，持續(xù)氣流受限，導(dǎo)致肺通氣功能障礙。隨著病情的發(fā)展，肺組織的彈性日益減退，肺泡持續(xù)擴(kuò)大、回縮障礙，則殘氣量及殘氣量占肺總量的百分比增加。肺氣腫加重導(dǎo)致大量肺泡周圍的毛細(xì)血管受膨脹、肺泡的擠壓而退化，致使毛細(xì)血管大量減少，肺泡間的血流量減少，此時(shí)肺泡雖有通氣但肺泡壁無(wú)血流灌流，導(dǎo)致無(wú)效腔增大;也有部分肺區(qū)雖有血流灌流但肺泡通氣不良，不能參與氣體交換，導(dǎo)致功能性分流增加，從而產(chǎn)生通氣與血流比例失調(diào)。同時(shí)肺泡及毛細(xì)血管大量喪失，彌散面積減少，通氣與血流比例失調(diào)，與彌散障礙共同作用致?lián)Q氣功能發(fā)生障礙，通氣與換氣功能障礙可引起缺氧和二氧化碳潴留，發(fā)生不同程度的低氧血癥和高碳酸血癥，最終出現(xiàn)呼吸功能衰竭［5］。因此，血?dú)鈾z查可間接反映COPD過(guò)程中肺通氣與換氣功能變化。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治?pH、PaO2、SaO2均顯著降低(P＜0.05)，提示COPD模型大鼠肺功能通氣與換氣功能障礙，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性炎癥是COPD特征性的改變，T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞均參與COPD的發(fā)病過(guò)程［6］。IL-4是輔助性T細(xì)胞2(Th2)的標(biāo)志性細(xì)胞因子，對(duì)氣道炎癥的發(fā)展起主導(dǎo)作用，它可以刺激B細(xì)胞的活化，增殖并誘導(dǎo)其分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白E(IgE)，參與氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，趨化嗜酸性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，與輔助性T細(xì)胞1(Th1)的標(biāo)志性細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)之間具有拮抗作用［7］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M IL-4的含量明顯升高(P＜0.05)，可能參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。

R285.5

B

1006-3250(2016) 01-0057-02

甘肅省科技支甘計(jì)劃-芪蛭皺肺顆粒的開發(fā)研究(1011JKCA175，1212RJA074);蘭州市科技計(jì)劃(2009-1-141);甘肅省教育廳科研項(xiàng)目(0505-02);甘肅省財(cái)政廳高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2012-2)

張 毅(1967-)，男，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事道地藥材防治呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與研究。

△通訊作者:李金田(1964-)，男，教授，醫(yī)學(xué)碩士，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel: 0931-8627950。