莊先飛，柴程芝，寇俊萍，余伯陽(yáng)

(江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198)

氣陰兩虛證易誘發(fā)心血管事件的實(shí)驗(yàn)研究*

莊先飛，柴程芝，寇俊萍，余伯陽(yáng)△

(江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198)

目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)氣陰兩虛證人群更易發(fā)生心血管事件，為臨床氣陰兩虛證的合理干預(yù)提供參考依據(jù)。方法: ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、異丙腎上腺素組、慢性間歇性缺氧組及慢性間歇性缺氧復(fù)合異丙腎上腺素組，測(cè)定各組小鼠心電圖、超聲心動(dòng)圖、血清CK-MB、hs-CRP含量，觀察小鼠心臟組織病理變化。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，各模型組小鼠均出現(xiàn)心臟形態(tài)或功能異常，表現(xiàn)為心肌缺血、心肌耗氧量增加、心肌細(xì)胞空泡化和心肌酶升高，其中復(fù)合模型組損傷最為嚴(yán)重，與異丙腎上腺素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:模擬氣陰兩虛證的慢性間歇性缺氧小鼠在給予異丙腎上腺素后，其心肌形態(tài)及功能損傷較單純給予異丙腎上腺素小鼠更為嚴(yán)重，提示氣陰兩虛證人群在心肌耗氧量增加時(shí)有可能更易發(fā)生心血管事件，為臨床氣陰兩虛證的合理有效干預(yù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

氣陰兩虛證;慢性間歇性缺氧;心肌缺血;心血管事件

急性心肌缺血誘發(fā)的心絞痛、心肌梗死等心血管疾病是危害人類健康的重大疾病，其致殘率、致死率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并造成沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。隨著人類疾病譜的演變，醫(yī)療模式已由單純的疾病治療轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)防、保健、治療、康復(fù)相結(jié)合的模式，疾病的早期預(yù)防越來(lái)越引起醫(yī)藥工作者的重視。文獻(xiàn)及臨床流行病學(xué)研究均顯示，氣陰兩虛證是臨床常見(jiàn)證型［2］860，常見(jiàn)于冠心?。?］、慢性心力衰竭［4］、急性心肌梗死［5］等心血管疾病，提示氣陰兩虛證患者可能存在心臟形態(tài)與功能的異常變化，在心肌耗氧量突然增加的情況下，更易誘發(fā)心絞痛、心肌梗死等心血管事件，但目前尚缺乏臨床流行病學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道。

本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用能夠模擬氣陰兩虛證臨床特征的慢性間歇性缺氧(CIH)動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)［6-7］，考察慢性間歇性缺氧小鼠在急性心肌耗氧量增加時(shí)心臟形態(tài)與功能的變化，試圖從實(shí)驗(yàn)研究角度評(píng)價(jià)氣陰兩虛證人群對(duì)心臟病事件的易感性，為臨床氣陰兩虛證的合理有效干預(yù)提供參考。

1 材料

1.1 試劑

CK-MB ELISA試劑盒、hs-CRP ELISA試劑盒均由南京市建成生物工程研究所提供;鹽酸異丙腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H31021344，批號(hào)130701);氯化鈉注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022336(批號(hào)1307171334)。

1.2 動(dòng)物

雄性ICR小鼠，體質(zhì)量(22±2)g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇) 2012-0004)。

1.3 儀器

XF-YC06型低壓氧倉(cāng)全自動(dòng)控制儀(簡(jiǎn)稱低壓氧儀，南京新飛分析儀器制造有限公司);Vevo2100型超聲心動(dòng)儀(簡(jiǎn)稱超聲儀，加拿大Visual Sonics公司);BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);DFC450C型顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)。

2 方法

2.1 造模方法

32只雄性ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(Control)、異丙腎上腺素組(ISO)、慢性間歇性缺氧組(CIH)及慢性間歇性缺氧復(fù)合異丙腎上腺素組(CIH+ISO)，每組各8只飼養(yǎng)于同一籠內(nèi)。Control組及ISO組小鼠自由進(jìn)食、飲水，CIH組及CIH+ISO組小鼠自由飲水，每晚9點(diǎn)開(kāi)始持續(xù)禁食12 h，次日9點(diǎn)前放入氧分壓為7%～8% 的低壓氧儀中持續(xù)缺氧20 min，每天1次，連續(xù)14 d。ISO組及CIH+ISO組小鼠在第15天尾靜脈注射鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO)0.1 ml/10 g(相當(dāng)于異丙腎上腺素5 mg/kg)，其余組小鼠尾靜脈注射等量的氯化鈉注射液。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 心電圖測(cè)定 小鼠缺氧第15天腹腔注射4%水合氯醛0.1 ml/10 g麻醉，采用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)心電模式，描記尾靜脈注射ISO前后的小鼠心電圖，觀察小鼠T波抬高情況。

2.2.2 超聲檢測(cè) 小鼠第15天麻醉后，于尾靜脈注射0.5 h后，采用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

2.2.3 血清中CK-MB、hs-CRP含量測(cè)定 小鼠尾靜脈注射ISO后2 h眼底靜脈叢取血，4℃沉降30 min后3500 r/min離心15 min，取上清分裝置于－70℃待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定CK-MB、hs-CRP的含量。

2.2.4 病理組織檢測(cè) 將小鼠離體心臟浸泡于福爾馬林溶液中24 h用石蠟包埋后切片，采用HE染色處理后于光鏡下觀察心臟的病理變化。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心電圖測(cè)定

圖1顯示，與空白組比較，ISO及CIH+ISO組小鼠心電圖均表現(xiàn)為T波抬高，提示有心肌缺血表現(xiàn)。

圖1 不同模型組小鼠心電圖T波變化

3.2 超聲檢測(cè)

圖2、3顯示，與空白組比較，ISO及CIH+ISO組小鼠心臟的EF和FS顯著升高(P＜0.01)，且與ISO組小鼠心臟的EF和FS比較，CIH+ISO組升高更顯著(P＜0.01)，提示復(fù)合模型小鼠心肌耗氧量較單純異丙腎上腺素組顯著升高。

圖2 不同模型組小鼠超聲心動(dòng)檢測(cè)圖

圖3 不同模型組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)EF(A)、縮短分?jǐn)?shù)FS(B)統(tǒng)計(jì)柱狀圖

3.3 血清中CK-MB、hs-CRP含量測(cè)定

圖4顯示，與空白組比較，各模型組小鼠心臟組織中CK-MB和hs-CRP含量明顯升高(P＜0.01)，提示各模型組小鼠心臟都存在不同程度的損傷; CIH+ISO組小鼠心臟的CK-MB和hs-CRP含量升高最明顯，與ISO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示復(fù)合模型的心肌損傷更嚴(yán)重。

圖4 不同模型組小鼠血清CK-MB(A)、hs-CRP(B)含量

3.4 病理組織檢測(cè)

圖5顯示，空白組小鼠心肌細(xì)胞光鏡下胞漿紅染、橫紋清晰、核居中，心肌間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)結(jié)締組織增生。與空白組比較，各模型組心肌細(xì)胞均出現(xiàn)輕微或輕度空泡變性，其中復(fù)合模型組損傷最嚴(yán)重。

圖5 不同模型組小鼠心臟病理切片圖(A)及病理?yè)p傷評(píng)分(B)

4 討論

課題組在前期研究中已采用益氣養(yǎng)陰的代表方生脈散干預(yù)，通過(guò)“以方測(cè)證”的方法初步確證慢性間歇性缺氧小鼠模型的氣陰兩虛證候?qū)傩裕?］。本研究則進(jìn)一步比較了慢性間歇性缺氧小鼠與慢性間歇性缺氧復(fù)合異丙腎上腺素造模小鼠心肌形態(tài)及功能的變化，驗(yàn)證模擬氣陰兩虛證的慢性間歇性缺氧小鼠在急性心肌耗氧量增加的情況下心臟損傷加重的可能性。

心電圖及超聲心動(dòng)圖是臨床考察心臟功能與形態(tài)的常用檢測(cè)方法，小鼠心電圖T波抬高提示有心肌缺血改變［8］。超聲心動(dòng)圖結(jié)果也顯示，ISO作為β受體激動(dòng)劑，可以明顯升高左心室射血分?jǐn)?shù)及縮短分?jǐn)?shù)，增加心肌耗氧量，加重心肌缺血損傷。本研究結(jié)果顯示，CIH+ISO組小鼠心肌耗氧量較單純ISO組明顯增加，心肌缺血程度更嚴(yán)重。

CK-MB是臨床用于診斷心肌梗死的常用血清學(xué)指標(biāo)，曾被譽(yù)為診斷急性心肌梗死(AMI)的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。C反應(yīng)蛋白(CRP)是肝臟合成的急性期反應(yīng)蛋白，是炎癥、感染及組織損傷的非特異性產(chǎn)物，也是急慢性炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物。超敏CRP(hs-CRP)因其較高的檢測(cè)精度，目前常用來(lái)預(yù)測(cè)冠心病事件的發(fā)生［10］。本研究考察了不同模型組小鼠血清CK-MB和hs-CRP的含量，結(jié)果提示CIH+ISO組小鼠較單純ISO組小鼠的心肌損傷程度更嚴(yán)重，發(fā)生冠心病、心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)更高。組織病理切片是評(píng)價(jià)動(dòng)物器官損傷程度的“金指標(biāo)”，本研究考察了不同模型組小鼠心臟組織病理切片的變化，結(jié)果與血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)論相一致。

綜上所述，本研究采用臨床常用的檢測(cè)指標(biāo)結(jié)合經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)，考察了模擬氣陰兩虛證的CIH小鼠在急性心肌耗氧量增加時(shí)心電圖T波、左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)及縮短分?jǐn)?shù)(FS)的變化，血清CK-MB、hs-CRP的含量以及心肌細(xì)胞的病理變化特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CIH小鼠給予ISO后心臟形態(tài)與功能的損傷較ISO組更為嚴(yán)重。提示氣陰兩虛患者在突遇急性心肌耗氧量增加事件時(shí)，心肌損傷將較正常人群更嚴(yán)重。本研究為氣陰兩虛證患者的預(yù)防與保健以及氣陰兩虛證適時(shí)干預(yù)以減少心臟不良事件的發(fā)生提供了參考依據(jù)，該結(jié)論還有待于臨床流行病學(xué)研究的進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］蘇定馮，陳豐原．心血管藥理學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:621．

［2］趙瓊，嚴(yán)石林，陳為，等．論氣陰兩虛證發(fā)展源流［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，10:853-854．

［3］石剛，劉婷，程丑夫．冠心病常見(jiàn)證候臨床流行病學(xué)調(diào)查［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(8):1675-1676．

［4］鄒旭，潘光明，盛小剛，等．慢性心力衰竭中醫(yī)證候規(guī)律的臨床流行病學(xué)調(diào)查研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31 (7):903-908．

［5］王玲，鄒志東，劉紅旭．急性心肌梗死中醫(yī)證候規(guī)律研究［J］．中國(guó)中醫(yī)急癥，2007，16(3):302-305，310．

［6］Chai CZ，Kou JP，Zhu DN，et al．Mice Exposed to Chronic Intermittent Hypoxia Simulate Clinical Features of Deficiency of both Qi and Yin Syndrome in Traditional Chinese Medicine［J］．eCAM，2011，doi:10.1093/ecam/nep226．

［7］王文萍，柴程芝，寇俊萍，等．基于“方證相應(yīng)”理論驗(yàn)證慢性間歇性缺氧模型氣陰兩虛證候?qū)傩缘某醪窖芯浚跩］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(1):50-52，．

［8］Zhangyu Yao，Shubo Gong，Teng Guan，et al．Synthesis of ranolazine metabolites and their anti-myocardial ischemia activities［J］．Chem Pharm Bull，2009，57(11):1218-1222．

［9］崔杰峰，潘柏申．急性心肌梗死血清標(biāo)志物沿革［J］．上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15(1):13-14．

［10］Kinjo K，Sato H，Ohnishi Y，et al．Impact of high-sensitivity C-reactive protein on predicting long-term mortalityofacute myocardial infarction［J］．Am J Cardiol，2003，91:931-935．

Experimental study on cardiovascular events can be easily induced by the Qi-yin deficiency syndrome

ZHUANG Xian-fei，CHAI Cheng-zhi，KOU Jun-ping，YU Bo-yang△
(Jiangsu Provincial Key Laboratory for TCM Evaluation and Translational Research，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Objective:To confirm the tendency of those people with Deficiency of both qi and yin syndrome(DQYS) suffering from cardiovascular events by experimental research，and to provide a reference for rational management with DQYS people．Methods:Male ICR mice were randomly divided into the control group，Isoprinosine(ISO)group，chronic intermittent hypoxia(CIH)group，and the group of CIH combined with ISO(CIH+ISO)．Then electrocardiogram and ultrasonic cardiogram were both adopted to examine the alteration of T wave and ejection fraction(EF)．Serum contents of CK-MB and hs-CRP were both determined by ELISA，and the cardiac pathological changes were observed by HE stain．Results Compared with the control group，mice in model group presented abnormal cardiac morphology or function，manifested as myocardial ischemia，increased myocardial oxygen consumption and myocardial cell vacuolization，as well as myocardial enzyme elevation．Among the three model groups，especially the mice in CIH+ISO group showed the most serious injury(P＜0.05，compared with the ISO group)．Conclusion:Mice exposed to CIH condition could simulate the main clinical features of DQYS，and injection of ISO could induce the CIH model mice to present more serious cardiac damage compared with the ISO model mice．The results showed that people with DQYS are inclined to suffer from cardiovascular events，such as angina，myocardial infarction，etc．The present study also provided a rational management proposal for those susceptible people with DQYS．

Deficiency of both qi and yin syndrome;chronic intermittent hypoxia;myocardial ischemia; cardiovascular events

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0047-03

2015-05-12

江蘇省科技廳臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)(BL2012060);國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81303076);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274004)

莊先飛(1990-)，女，山東泰安人，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥復(fù)方作用機(jī)制研究。

△通訊作者:余伯陽(yáng)，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合藥學(xué)研究，E-mail:boyangyu59@163．com。