侯 妮，劉 娜，韓 佳，李 杰

(西安交通大學：1. 醫(yī)學部細胞生物學與遺傳學系，陜西西安 710061；2. 第二附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安 710004)

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3-MA通過抑制自噬反應(yīng)提高結(jié)腸癌5-FU的化療效果

侯 妮1，劉 娜1，韓 佳1，李 杰2

(西安交通大學：1. 醫(yī)學部細胞生物學與遺傳學系，陜西西安 710061；2. 第二附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安 710004)

目的 探索新的聯(lián)合化療方案以提高5-FU為基礎(chǔ)的結(jié)腸癌化療效果。方法 研究5-FU(7.5 μmol/L)、3-MA(5 mmol/L)以及兩種藥物聯(lián)合使用對人結(jié)腸癌細胞株HCT116的自噬及凋亡影響。MTT、Hoechst+PI染色檢測細胞生長及凋亡，MDC染色觀察細胞內(nèi)自噬反應(yīng)，Western blotting觀察細胞內(nèi)的凋亡及自噬相關(guān)蛋白改變。將HCT116細胞注射至裸鼠皮下建立在體腫瘤模型并進行治療，觀察腫瘤生長情況。結(jié)果 MTT檢測結(jié)果顯示HCT116在5-FU作用下細胞生長受到抑制，Hoechst+PI染色顯示5-FU聯(lián)合3-MA組凋亡數(shù)量較5-FU組明顯增加；Western blotting檢測5-FU聯(lián)合3-MA組的凋亡蛋白Caspase-3、PARP表達較5-FU組明顯增高。同時，MDC染色以及自噬特異性蛋白LC3II檢測發(fā)現(xiàn)在5-FU作用下自噬反應(yīng)升高，而通過3-MA抑制5-FU引起的細胞自噬反應(yīng)，細胞生長抑制率從5-FU單獨作用的(51.64±4.04)%提高至(79.89±1.35)%，凋亡增加超過100%。皮下注射HCT116細胞的裸鼠腫瘤模型，5-FU聯(lián)合3-MA組較單獨使用5-FU組有效抑制腫瘤生長，腫瘤體積及質(zhì)量均明顯減少。結(jié)論 3-MA可抑制5-FU處理引起的細胞自噬反應(yīng)，促進細胞凋亡，HCT116細胞生長抑制率明顯增加；為提高5-FU為基礎(chǔ)的結(jié)腸癌化療提供新思路。

結(jié)直腸癌；5-FU；3-MA；凋亡；自噬；化療；Caspase-3；PARP；LC3

結(jié)直腸癌是一種嚴重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率居各種惡性腫瘤第2位，致死率居第3位。發(fā)展中國家近年來的結(jié)直腸癌發(fā)病率明顯升高，且趨于年輕化[1]。目前手術(shù)切除是結(jié)直腸癌的主要治療方法，但對于中晚期患者，需要化療來緩解癥狀以延長生命[2]。上世紀80年代，5-FU已用于結(jié)直腸癌的化療，至1999年5-FU/leucovorin的治療方案成為結(jié)直腸癌化療的金指標，2000年以后奧沙利鉑、依立替康等藥物聯(lián)合5-FU化療方案也應(yīng)用于臨床治療中[3]。但是，療效始終有限，需要探索和研究以提高結(jié)直腸癌對5-FU化療的敏感性。

自噬是細胞內(nèi)的一種降解途徑，通過降解衰老受傷的細胞器及一些大分子蛋白質(zhì)來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，自噬與惡性腫瘤、遺傳性肌病及神經(jīng)變性性疾病等多種疾病有關(guān)。其中，自噬與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療的關(guān)系正成為研究的焦點。大量的研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以導致腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡，提高腫瘤化療效果。但同時也有研究發(fā)現(xiàn)自噬可以幫助腫瘤細胞耐受或阻止化療藥物毒性所引起的細胞破壞。因此，解析自噬與腫瘤之間的復(fù)雜關(guān)系，有利于腫瘤治療新靶點的探索[5]。本研究觀察5-FU單用或聯(lián)用自噬抑制劑3-MA對人結(jié)腸癌細胞HCT116生長、凋亡的影響及自噬反應(yīng)激活情況，并進一步進行在體實驗驗證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體

5-FU(5-fluorouracil)和3-MA(3-methyladenine)均購于美國Sigma公司。3-MA被用作自噬抑制劑，30 mg溶解于1mL dH2O中配制成200 mmol/L并室溫保存。MDC(monodansylcadaverine)是一種熒光染料，被用作自噬活性變化的示蹤劑，購于美國Sigma公司?？笴aspase-3、PARP抗體均購于美國Cell Signaling Technologies公司，LC3抗體為日本MBL公司，β-actin抗體為美國Sigma公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細胞株HCT116由西安交通大學醫(yī)學部細胞生物學與遺傳學系提供。HCT116細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有100 mL/L胎牛血清并添加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，并置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3 MTT法檢測細胞生長抑制率及實驗分組

HCT116細胞種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)為4×103。HCT116在不同濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)5-FU作用48 h后，每孔內(nèi)加入MTT溶液(50 μg/mL)，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，移除培養(yǎng)液，每孔內(nèi)加入150 μL DMSO并振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測490 nm波長處每孔吸光度值(A)，進而計算細胞生長抑制率。抑制率=1-(試驗組A/對照組A)×100%，結(jié)果表示為平均抑制率±標準差。

實驗分組根據(jù)1.3實驗結(jié)果選取適宜的5-FU濃度，取對數(shù)生長期細胞分成4組進行治療干預(yù)實驗，分別為對照組(無藥物處理)、3-MA組(5 mmol/L 3-MA處理)、5-FU組(7.5 μmol/L 5-FU處理)及3-MA聯(lián)合5-FU治療組(7.5 μmol/L 5-FU與5 mmol/L 3-MA共同處理)，分別干預(yù)48 h。每組設(shè)5個復(fù)孔。MTT法檢測細胞生長抑制率情況。

1.4 MDC染色檢測各干預(yù)組細胞內(nèi)自噬情況

自噬改變通過MDC染料檢測，MDC可標注自噬泡，并通過熒光顯微鏡進行觀察。4組細胞干預(yù)48 h，加入0.05 mmol/L MDC在37 ℃孵育10 min后，置于熒光顯微鏡(ECLIPSE TE2000-U, Nikon)下，在380 nm激發(fā)波下進行觀察并采集圖像。

1.5 Western blotting檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達

分別收集4組細胞于細胞裂解液[20 mmol/L Tris-HCl pH 7.6，1 mmol/L EDTA，140 mmol/L NaCl，NP-40，1% aprotinin, 1 mmol/L phenylemethylsulfonyl fluoride(PMSF)，1 mmol/L sodium vanadate]中裂解。通過BCA Protein Assay kit (Pierce)進行蛋白質(zhì)濃度定量。取20 μg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，充分干燥。50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，依次給以一抗(LC3、Caspase-3或PARP抗體，稀釋比均為1∶1 000)、連接辣根過氧化物酶的二抗孵育(稀釋度為1∶5 000)后，ECL(Millpore)發(fā)光，掃描儀掃描并保存圖像。

1.6 Hoechst+PI染色

DNA結(jié)合染料Hoechst 33342(10 μmol/L)和PI(10 μmol/L)標記凋亡細胞，380 nm激發(fā)波熒光顯微鏡下進行觀察。凋亡細胞可觀察到破碎的凋亡小體呈藍色或紅色熒光。而正常存活細胞或壞死細胞，仍顯示出完整的細胞核呈藍色或紅色。最少觀察4個視野不少于500個細胞，并計算細胞凋亡率。

1.7 建立動物模型及實驗

皮下注射HCT116細胞懸液于裸鼠右脅部。當腫瘤體積達預(yù)定值(180～350 mm3，大約在注射后10 d左右)，裸鼠被隨機分成4組進行治療干預(yù)：對照組、3-MA組、5-FU組及3-MA聯(lián)合5-FU組。30 mg/kg 5-FU、24 mg/kg 3-MA分別溶于100 μL鹽水中，按照預(yù)定分組注射于裸鼠腹腔內(nèi)，每5 d注射1次，共計5次。對照組同時注射100 μL鹽水進行對照觀察。每5 d觀察1次腫瘤體積，腫瘤體積通過公式V=1/2ab2(a為腫瘤最大直徑，b為腫瘤最小直徑)進行估算。1月后切除腫瘤新生物并拍攝照片，同時測量腫瘤體積及質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，所得數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標準差”表示，兩組比較采用unpaired Student’st-test，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3-MA可增強5-FU對HCT116的生長抑制作用

MTT檢測結(jié)果顯示，HCT116在不同濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)5-FU作用48 h后，細胞生長受到明顯抑制，具有一定的濃度依賴關(guān)系。7.5 μmol/L 5-FU作用48 h的細胞生長抑制率可達(51.64±4.04)%(圖1A)。據(jù)此，7.5 μmol/L 5-FU處理HCT116細胞48 h被用于后續(xù)實驗中。

MTT檢測4組干預(yù)處理組細胞結(jié)果顯示，5-FU、3-MA聯(lián)合組HCT116細胞生長抑制率從5-FU單獨作用下的(51.64±4.04)%提高至(79.89±1.35)%，而單獨使用3-MA所造成的細胞抑制較對照組僅有輕微升高(圖1B)。

圖1 MTT法檢測細胞生長抑制率的變化

Fig.1 Changes of cell survival in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：不同濃度5-FU作用HCT116細胞48 h；B：與單獨5-FU對比，聯(lián)合使用3-MA與5-FU顯著提高細胞生長抑制率，**P<0.01(結(jié)果取自至少3次獨立重復(fù)實驗)。

2.2 3-MA可以抑制5-FU引起的HCT116自噬的激活

MDC是一種熒光染料，用于標記細胞內(nèi)酸性顆粒，常被用作自噬活性改變的示蹤劑。而3-MA是磷脂酰肌醇3激酶的抑制劑，進而影響自噬泡的發(fā)生，被廣泛用作自噬的抑制劑[6]。MDC檢測發(fā)現(xiàn)，5-FU組HCT116細胞質(zhì)中或核周圍區(qū)域光點樣結(jié)構(gòu)較對照組明顯增加，提示5-FU在抑制細胞生長的同時，細胞內(nèi)自噬反應(yīng)被激活。而聯(lián)合3-MA處理細胞后，光點樣結(jié)構(gòu)減少，提示3-MA有效抑制5-FU引起的自噬反應(yīng)(圖2A)。

通過LC3蛋白免疫印跡方法驗證顯示同樣結(jié)果(圖2B)，在自噬反應(yīng)激活時，細胞胞質(zhì)中可溶性LC3I(18 ku)與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成LC3II(16 ku)，LC3II含量以及LC3II/LC3I的值通常用來反映細胞的自噬活性[7]。Western blotting結(jié)果中條帶灰度通過軟件(Gel Plotting Macros of NIH image 1.62)量化，計算LC3II/LC3I。與5-FU組對比，聯(lián)合使用3-MA使得LC3II/LC3I比值明顯減少(圖2C)。

2.3 3-MA明顯增加5-FU引起細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達變化

Hoechst+PI染色顯示，5-FU聯(lián)合3-MA組凋亡數(shù)量較5-FU組明顯增加，通過在高倍鏡視野中計數(shù)500個以上細胞，發(fā)現(xiàn)5-FU聯(lián)合3-MA組凋亡數(shù)量較5-Fu組中增加超過1倍(圖3A)。Western blotting檢測凋亡蛋白Caspase-3及PARP活性片段增多(圖3B)。這提示5-FU在抑制細胞生長的同時，可導致細胞發(fā)生凋亡，而3-MA明顯增加凋亡。

2.4 5-FU聯(lián)合使用3-MA的在體實驗顯示有效抑制腫瘤生長

裸鼠皮下種植腫瘤細胞后10 d，按照預(yù)定實驗方案進行分組治療。實驗全程各組裸鼠體質(zhì)量及健康程度無明顯差異。5-FU聯(lián)合3-MA組較單獨5-FU組腫瘤形成明顯緩慢(圖4A)；35 d后終止實驗時，單獨5-FU組和聯(lián)合處理組的腫瘤體積分別為(1.61±0.78)cm3和(0.5±0.45)cm3；腫瘤質(zhì)量分別為(0.74±0.44)g和(0.45±0.24)g。5-FU聯(lián)合3-MA組裸鼠最終形成的腫瘤明顯小于和輕于單獨5-FU組，有效抑制腫瘤的生長(圖4B和4C)。

圖2 5-FU和/或3-MA作用于HCT116細胞的自噬改變

Fig.2 Changes of autophagy in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：各組細胞的MDC染色結(jié)果(×200)；B：Western blotting檢測各組細胞中LC3蛋白的表達結(jié)果；C：LC3II/LC3I的量化結(jié)果，與5-FU組比較，*P<0.05(結(jié)果取自至少3次獨立重復(fù)實驗)。

圖3 Hoechst+PI染色及Western blotting檢測凋亡蛋白表達

Fig.3 Changes of apoptosis in HCT116 treated by 5-FU or/and 3-MA
A：各組細胞的Hoechst+PI染色結(jié)果(×200)；B：各組細胞中Caspase-3及PARP蛋白的表達結(jié)果(結(jié)果取自至少3次獨立重復(fù)實驗)。

圖4 聯(lián)合應(yīng)用5-FU、3-MA明顯抑制裸鼠腫瘤生長

Fig.4 Inhibition of xenograft growth by combination of 5-FU and 3-MA
A：各組腫瘤體積的改變；B：各組形成腫瘤的大體病型照片；C：各組形成腫瘤的質(zhì)量比較。*P<0.05(結(jié)果取自至少3次獨立重復(fù)實驗)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤疾病，化療能夠有效地減少腫瘤的復(fù)發(fā)并延長患者生命。然而越來越多抗藥性的產(chǎn)生嚴重影響到結(jié)直腸癌的治療效果，急需研究新的化療方法。本研究通過體外及在體實驗發(fā)現(xiàn)，5-FU抑制結(jié)直腸癌細胞的生長，并可導致細胞凋亡，同時細胞內(nèi)自噬反應(yīng)被激活；通過自噬抑制劑3-MA抑制自噬反應(yīng)，細胞凋亡明顯增加，裸鼠皮下種植腫瘤體積大幅度縮小，提高了5-FU結(jié)直腸癌化療效果。

已發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤有著密切聯(lián)系。如在腫瘤早期，自噬能夠損傷腫瘤細胞而抑制腫瘤的發(fā)生；在進展期，自噬又似乎促進腫瘤的發(fā)展，腫瘤中心區(qū)的細胞可以通過自噬反應(yīng)來耐受低氧及低營養(yǎng)的環(huán)境。特別是在腫瘤化療過程中，自噬能夠通過隔離并降解被藥物破壞的蛋白或細胞器，而保護細胞并對抗化療藥物，降低化療藥物療效[8]。

3-MA是一種經(jīng)典的自噬抑制劑，近來有許多研究發(fā)現(xiàn)，3-MA能夠有效地聯(lián)合化療藥物促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。如HERMAN-ANTOSIEWICZ等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細胞中，3-MA可以通過促進細胞色素C在細胞質(zhì)中的釋放而促進sulforaphane導致的PC-3細胞凋亡。而在乳腺癌MCF-7細胞中，3-MA同樣可以增加100 g/L喜樹堿所導致的細胞死亡[10]。本實驗也同樣發(fā)現(xiàn)，在5-FU作用下，人結(jié)腸癌細胞中自噬反應(yīng)增加，通過3-MA抑制后，細胞凋亡增加1倍以上。自噬對細胞的作用具有兩面性：既可以作為細胞生長的“朋友”，也可能成為“敵人”，這取決于疾病進展的不同階段、細胞周圍環(huán)境的變化和治療干預(yù)措施的不同。因此，更深入地研究5-FU導致細胞內(nèi)自噬反應(yīng)發(fā)生的機制及自噬與凋亡間的聯(lián)系，自噬與腫瘤之間的聯(lián)系等，并將對自噬的干預(yù)用于腫瘤治療中，將是今后的研究重點并成為腫瘤治療的新亮點。

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(編輯 國 榮)

3-MA enhances chemotherapeutic effect of 5-FU by inhibiting autophagy in colon cancer

HOU Ni1, LIU Na1, HAN Jia1, LI Jie2

(1. Department of Cell Biology and Genetics, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061; 2. Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To explore a novel adjuvant strategy of improving 5-fluorouracil (5-FU)-based chemotherapy for colorectal cancer. Methods Human colon cancer cell (HCT 116) was used to investigate the effect of 5-FU (7.5 μmol/L), 3-methyladenine (3-MA, 5 mmol/L), or their combination on apoptotic cell death and autophagy. MTT assay was used to observe the suppression of cell survival. Hoechst plus PI staining and MDC assay was used to detect apoptosis and autophagy. Western blotting was used to explore the molecular changes. Finally, the experiment results were further examinedinvivo. Results We found that the survival of HCT116 was suppressed by 5-FU and the combination of 5-FU and 3-MA promoted the apoptosis. Autophagy was activated by 5-FU treatment and 3-MA inhibited 5-FU-induced autophagy. The suppression of cell survival increased from (51.64±4.04)% to (79.89±1.35)%, and the apoptosis increased by more than 100%. HCT116 cells were injected in the nude mouse to produce tumor. The combination treatment of 5-FU and 3-MA inhibited the growth of xenografts compared with 5-FU alone. Conclusion 3-MA enhances 5-FU-induced apoptosis by inhibiting autophagy in HCT116, and this could be a promising strategy for colorectal cancer chemotherapy.

colorectal cancer; 5-FU; 3-MA; apoptosis; autophagy; chemotherapy; Caspase-3; PARP; LC3

2015-05-05

2015-10-13

國家自然科學基金資助項目(No.81172358) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81172358)

李杰. E-mail: lijie_0531@163.com

R73-36; R735.3

A

10.7652/jdyxb201601009

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1503.002.html(2015-12-09)