張麗，趙飛駿，張曉紅

(1 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南衡陽(yáng) 421001；2 常德市第一人民醫(yī)院)

梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及其應(yīng)用進(jìn)展

張麗1,2，趙飛駿1，張曉紅1

(1 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南衡陽(yáng) 421001；2 常德市第一人民醫(yī)院)

梅毒發(fā)病周期長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，漏診或誤診率較高，目前尚無(wú)對(duì)各期梅毒都有高敏感性和特異性的檢測(cè)方法。本文通過(guò)綜述梅毒螺旋體顯微鏡檢、梅毒螺旋體非特異性抗體試驗(yàn)、梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在各期梅毒檢測(cè)中的研究及應(yīng)用進(jìn)展，為臨床醫(yī)生提供參考意見。對(duì)于懷疑一期梅毒但血清學(xué)梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)檢測(cè)陰性者，應(yīng)取分泌物進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，或選用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)，或建議患者定期復(fù)查。對(duì)于二期、三期及隱性梅毒患者，應(yīng)首選血清學(xué)梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)檢測(cè)。

梅毒螺旋體；實(shí)驗(yàn)室診斷方法

梅毒是一種慢性性傳播疾病，近年來(lái)發(fā)病率明顯上升；其病原菌是蒼白密螺旋體蒼白亞種，即梅毒螺旋體(Tp)。梅毒發(fā)病周期較長(zhǎng)，可侵犯全身各組織器官，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，各期梅毒患者都可伴有無(wú)病癥的潛伏期，目前臨床上并沒有對(duì)各期梅毒都有較高敏感性和特異性的檢測(cè)方法。本文對(duì)近年來(lái)實(shí)驗(yàn)室常用的梅毒檢測(cè)方法及其在各期梅毒診斷中的應(yīng)用作一綜述。

1 顯微鏡檢查

顯微鏡下可直接檢測(cè)到Tp，對(duì)一、二期梅毒的診斷有重要價(jià)值，具有快速、方便、易操作的特點(diǎn)，但常由于Tp含量低、皮損趨于好轉(zhuǎn)或已使用抗菌藥物等原因，易出現(xiàn)假陰性。Tp顯微鏡檢查主要包括鍍銀染色法、墨汁染色法、暗視野顯微鏡檢查法、 直接熒光免疫法(DFA)、多功能顯微診斷儀(MDI)檢查法和基于免疫組化的動(dòng)聚焦顯微鏡檢測(cè)法(FFM)。鍍銀染色法、墨汁染色法和暗視野顯微鏡檢查法對(duì)操作人員的要求較高，同時(shí)多種非致病螺旋體會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。DFA采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗Tp單克隆抗體，Tp陽(yáng)性者可在熒光顯微鏡下發(fā)出黃綠色熒光，從而排除非Tp的干擾，檢測(cè)特異性高。MDI檢查法是一種綜合明暗視野、相差對(duì)比及偏振光的多種視頻顯微檢查技術(shù)，該方法于顯微鏡下放大40～15 000倍，可觀察到菌體細(xì)微結(jié)構(gòu)，同時(shí)借助相差光源增強(qiáng)觀察的立體感?；诿庖呓M化的FFM首先要對(duì)樣本進(jìn)行免疫組化，再使用動(dòng)聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)移動(dòng)顯微鏡的聚焦、三維立體掃描帶菌組織，可檢測(cè)到極微量的Tp，該方法對(duì)三期梅毒的檢出率高達(dá)87%[1]。MDI和FFM由于儀器比較昂貴，目前尚無(wú)法在臨床普及。

2 非特異性抗體試驗(yàn)

Tp非特異性抗體試驗(yàn)以卵磷脂、心磷脂及膽固醇作為抗原，檢查Tp感染者血清中的反應(yīng)素(抗類脂抗原抗體)，對(duì)一期、二期梅毒的診斷價(jià)值較高，主要包括性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)、血清不加熱反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)、快速血漿反應(yīng)素(RPR) 環(huán)狀卡片試驗(yàn)等。梅毒患者經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后，RPR/TRUST滴度可降低或轉(zhuǎn)陰，故RPR/TRUST滴度可以用于判斷臨床療效。但由于機(jī)體在結(jié)核、瘧疾等其他疾病過(guò)程中也可產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，會(huì)造成Tp非特異性抗體試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。腦脊液(CSF)中VDRL法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性被認(rèn)為是診斷神經(jīng)梅毒的有力證據(jù)。研究報(bào)道，在CSF中，TRUST、RPR特異性與VDRL相似，而敏感性高于VDRL，可替代VDRL用于神經(jīng)梅毒的診斷[2]。試劑ITA3 RPR與RPR均可用于檢測(cè)血清中非特異性反應(yīng)素的試驗(yàn)，可結(jié)合免疫比濁法應(yīng)用于自動(dòng)生化分析儀，避免手工法檢測(cè)的人為誤差。Yukimasa等[3]研究報(bào)道，ITA3 RPR檢測(cè)梅毒的敏感性高于傳統(tǒng)RPR和VDRL，治療后的梅毒患者轉(zhuǎn)陰更快。

3 特異性抗體試驗(yàn)

Tp特異性抗體試驗(yàn)是以Tp全菌株或其成分作為抗原，檢測(cè)患者血清中有無(wú)特異性Tp抗體IgG或IgM，檢測(cè)特異性和敏感性均較高。Tp IgG檢測(cè)可用于診斷各期梅毒，但對(duì)早期梅毒檢出率不高，由于Tp IgG可終身攜帶，故不能作為治愈指標(biāo)。Tp IgM檢測(cè)可用于先天梅毒、早期梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷。大分子量Tp IgM不能通過(guò)胎盤，因此梅毒孕母的胎兒出生時(shí)或出生后不久檢測(cè)Tp IgM是診斷先天梅毒的重要手段。因?yàn)闄C(jī)體感染梅毒后首先產(chǎn)生的抗體是IgM，故梅毒感染早期Tp IgG檢測(cè)還是陰性時(shí)即可出現(xiàn)Tp IgM陽(yáng)性。Bosshard[4]研究發(fā)現(xiàn)，部分Tp明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)陰性的早期梅毒患者，采用ELISA法檢測(cè)血清Tp IgM可呈陽(yáng)性；由于梅毒特異性IgM相對(duì)分子量大，不能通過(guò)血腦屏障，因此CSF中出現(xiàn)Tp IgM是診斷神經(jīng)梅毒的有力證據(jù)?，F(xiàn)常用的Tp特異性抗體試驗(yàn)主要有梅毒全株抗原檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn)和梅毒重組抗原檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn)。

3.1 梅毒全株抗原檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn) 梅毒全株抗原檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn)中，熒光Tp抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)、Tp血凝集試驗(yàn)(TPHA)、Tp明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)均以Tp全菌株Nichols株作為抗原，檢測(cè)血清中Tp特異性抗體。FTA-ABS是一種Tp特異性抗體間接免疫熒光法，其對(duì)一、二、三期梅毒的敏感性分別為80%、99%～100%、95%～100%，特異性為92%[5]。Lin等[6]研究顯示，F(xiàn)TA-ABS-IgM檢測(cè)早期梅毒的敏感性高于TPPA-IgM。TPHA用羊紅細(xì)胞作為抗原載體，TPPA則用明膠顆粒作為抗原載體， 后者可避免前者血球自凝造成的漏診，因此敏感性和特異性均較高。研究報(bào)道，TPPA診斷梅毒的特異性為95%～100%，診斷一期、二期及隱性梅毒的敏感性分別為88%、100%、100%[7]。

3.2 梅毒重組抗原檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn) 目前，血清學(xué)診斷常用梅毒抗原有TpN15、TpN17、TpN47、TmpA。多種抗原融合可提高檢測(cè)的敏感性和特異性，常用的嵌合基因有TpN15-47、TpN15-17、TpN17-47、TpN15-47-17、TpN15-TmpA、TpN15-47-TmpA、TpN15-47-17-TmpA，陸續(xù)新發(fā)現(xiàn)的可用于梅毒診斷的抗原有TpF1、Tp0971、Tp0463、Tp0319、TpGpd、Tp0136 、Tp0821、Tp0319、Tp0663。楊斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Tp47、Tp15和Tp45在各期梅毒中都有較強(qiáng)的表達(dá)，可用于梅毒篩查，其中在各期表達(dá)有明顯差異的Tp41、Tp37和Tp33可考慮作為臨床分期觀察指標(biāo)。米希婷等[9]研究顯示，Tp17抗體在血清中出現(xiàn)較早，可用于一、二期梅毒的診斷；Tp15抗體在二期梅毒患者血清中的陽(yáng)性率較一期梅毒高。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、免疫印跡試驗(yàn)(WB)、免疫膠體金試驗(yàn)(GICA)、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法(TRFIA)、生物芯片技術(shù)、壓電免疫傳感器法和懸浮芯片技術(shù)均以梅毒重組抗原檢測(cè)血清中特異性梅毒抗體。

3.2.1 ELISA TP-ELISA采用基因重組表達(dá)的Tp特異性抗原包被在微孔板上，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，用雙抗原夾心法測(cè)定患者標(biāo)本中特異性梅毒抗體。張學(xué)杰等[10]采用上海實(shí)業(yè)科華生物工程有限公司提供的TP-ELISA試劑，檢測(cè)早期潛伏、一期、二期、三期梅毒陽(yáng)性率分別為83.3%、100.0%、100.0%、100.0%，總陽(yáng)性率為96.8%。該方法成本低廉，可實(shí)現(xiàn)儀器化檢測(cè)，是臨床大批量標(biāo)本檢測(cè)的理想方法，但受標(biāo)本中一些類過(guò)氧化物酶物質(zhì)的影響，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。捕獲TP-ELISA-IgM法以抗人IgM抗體(抗人u鏈)作為固相抗體，當(dāng)加入血清標(biāo)本時(shí)，其中的IgM抗體即可被固相抗體捕獲，加入酶標(biāo)記的特異性TP抗原后可以顯色。該方法可排除IgG的干擾，提高IgM檢測(cè)的敏感性和特異性。Nie等[11]報(bào)道了一種新的梅毒ELISA診斷方法，即電漿ELISA法，其測(cè)量范圍為1～10 ng/mL，檢出臨界值為0.98 pg/mL，檢測(cè)敏感性是傳統(tǒng)ELISA法的1 000倍。

3.2.2 CLIA TP-CLIA以Tp特異性蛋白制備成固相包被抗原，以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的Tp特異性蛋白作為檢測(cè)抗原，與樣品中的Tp抗體形成雙抗原夾心復(fù)合物，加入化學(xué)發(fā)光底物后測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，即可判斷樣品中是否含有Tp特異性抗體。該方法分辨率較ELISA法高，且不易受血漿中其他物質(zhì)的干擾。Liu等[12]報(bào)道，CLIA法的特異性為99.70%，敏感性為99.00%，既可作為篩選試驗(yàn)，又可作為診斷試驗(yàn)。

3.2.3 WB WB先將電泳分離的特異性抗原轉(zhuǎn)移至固相支持物，然后用特異性抗體作為探針檢測(cè)靶物質(zhì)，具有凝膠電泳技術(shù)的高分辨率和固相免疫檢測(cè)高特異性、高敏感性等特點(diǎn)。Novikov等[13]報(bào)道WB法對(duì)早期梅毒、二期梅毒、神經(jīng)梅毒的檢出率均為100%。另有研究發(fā)現(xiàn)，在WB檢測(cè)中，梅毒早期TpN47抗原對(duì)應(yīng)的抗體區(qū)帶即可出現(xiàn)，可作為早期梅毒的診斷指標(biāo)，TpN15和TpN17抗原對(duì)應(yīng)的抗體則有望作為療效觀察指標(biāo)[14]。

3.2.4 GICT GICT是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。TP-GICT采用純化的Tp重組抗原，以膠體金作為指示標(biāo)記，以雙抗原夾心法快速檢測(cè)血清中Tp特異性抗體。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，結(jié)果出現(xiàn)快、易于判讀，價(jià)格低廉，可用于梅毒快速篩查。Yin等[15]收集來(lái)自中國(guó)和尼日利亞的1 514例份血清樣本，用GICT技術(shù)制成的梅毒快速診斷檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)，診斷敏感性達(dá)98.3%～99.0%，特異性達(dá)97.2%～99.6%。

3.2.5 TRFIA TRFIA是用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨；該方法可排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析敏感性。TP-TRFIA應(yīng)用鑭系元素上金屬離子及其贅合物作為示蹤物代替酶，標(biāo)記螺旋體特異性抗原，待抗原抗體復(fù)合物形成后，加入增強(qiáng)液，后引入信號(hào)放大體系，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定終產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，根據(jù)相對(duì)熒光比值確定待測(cè)物濃度。Talha等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TP-TRFIA特異性高于TP-ELISA。

3.2.6 生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是通過(guò)縮微技術(shù)，將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ诠栊酒虿Ａ酒戎С治锷?，以?shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量檢測(cè)。Tp生物芯片技術(shù)將多種Tp特異性蛋白或基因探針集成到固化支持物上，制成芯片，檢測(cè)患者標(biāo)本中特異性梅毒抗體或基因片段。該方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量，微型化，試劑用量少，標(biāo)本體積??；缺點(diǎn)是生物芯片的制備成本高，檢測(cè)系統(tǒng)昂貴。Huang等[17]用梅毒特異性蛋白探針TpN15-17-47涂布生物芯片，檢測(cè)286例梅毒患者的血清樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與 TPPA方法的一致率達(dá)到97.9%。

3.2.7 壓電免疫傳感器法 壓電免疫傳感器是一種把特異性免疫反應(yīng)和高靈敏壓電質(zhì)量傳感結(jié)合在一起的免疫檢測(cè)方法，具有檢測(cè)快速、檢出臨界值低、敏感性高、成本低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于野戰(zhàn)條件下獻(xiàn)血者的快速篩查。單桂秋等[18]將梅毒重組抗原吸附、固定到鍍金石英晶體表面，運(yùn)用壓電免疫傳感陣列檢測(cè)技術(shù)快速檢測(cè)梅毒特異性抗體。與ELISA和TPPA作比對(duì)，一致率分別為90%和83%。

3.2.8 懸浮芯片技術(shù) 懸浮芯片技術(shù)利用帶編碼的微球體作為載體，以流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸和蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)，具有高通量、多樣本、多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，且所需樣本量小，可自動(dòng)化操作。陳峰等[19]分別將懸浮芯片技術(shù)與ELISA技術(shù)用于Tp檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者的一致率較好，前者檢測(cè)精確度優(yōu)于后者。

4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)

梅毒PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增特異性DNA的方法，對(duì)早期皮損標(biāo)本檢測(cè)敏感性高，但假陽(yáng)性率較高、試劑成本高、實(shí)驗(yàn)室條件要求高，目前只能作為血清學(xué)方法的補(bǔ)充。邱偉等[20]運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因Tp polA，檢測(cè)358例疑似初期梅毒患者及66例二期梅毒患者的肛門或生殖器潰瘍處拭子標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TPPA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，PCR技術(shù)適用于初期梅毒診斷，但是對(duì)于二期梅毒的診斷價(jià)值不及TPPA。

現(xiàn)階段梅毒PCR診斷常用的靶基因有Tp47和polA，其PCR檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)PCR、巢式PCR、熒光原位雜交技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。常規(guī)PCR利用已知的待擴(kuò)增目的基因片段的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)相應(yīng)的引物，以待檢標(biāo)本中的TpDNA為模板，如標(biāo)本中存在Tp，則可擴(kuò)增出目的基因。巢式PCR通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性DNA片斷，其敏感性是常規(guī)PCR的40倍。梅毒熒光原位雜交技術(shù)以熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針與Tp單鏈核酸雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)對(duì)Tp進(jìn)行定性或定量分析。Petrich等[21]以熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針TpALL(5′-TAGGCTAGTGACTTCGGGTATCTCC-3′)與Tp-16S rRNA雜交，經(jīng)過(guò)熒光檢測(cè)4例(其中2例HIV陽(yáng)性)組織病理檢查均陰性的梅毒患者，發(fā)現(xiàn)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明其敏感性高于組織病理檢查。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR體系中加入一段與目的擴(kuò)增序列互補(bǔ)的Taqman探針，PCR反應(yīng)中每擴(kuò)增出一條產(chǎn)物就會(huì)切下一條探針，使報(bào)告基團(tuán)的熒光增加一分，其檢測(cè)Tp的敏感性約為傳統(tǒng)PCR的250倍。

綜上所述，血清學(xué)檢測(cè)是梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法，國(guó)內(nèi)多數(shù)醫(yī)院采用敏感性、特異性高，可儀器批量檢測(cè)，價(jià)位也不高的ELISA法進(jìn)行初篩；采用梅毒特異性試驗(yàn)TPPA進(jìn)行確診，并配以簡(jiǎn)單、成本低廉的梅毒非特異性試驗(yàn)，如RPR法、TRUST法進(jìn)行梅毒療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染判斷。但各期梅毒血清學(xué)反應(yīng)有差異，應(yīng)有針對(duì)性地選擇實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。懷疑一期梅毒，但血清學(xué)檢測(cè)陰性者，應(yīng)取分泌物進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，或選用PCR法進(jìn)一步檢測(cè)，或建議患者定期復(fù)查。二期、三期、隱性梅毒者，首選血清學(xué)檢測(cè)。Tp IgM抗體及PCR檢測(cè)對(duì)早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒、復(fù)發(fā)梅毒的診斷及療效判斷有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，開發(fā)新的Tp蛋白重組診斷抗原，結(jié)合新的可增強(qiáng)檢測(cè)敏感性的技術(shù)方法，找到一些特異性更高、敏感性更好、快速、簡(jiǎn)便、低成本的檢測(cè)方法，是目前Tp實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373230、81301470)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014A020212036)；特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(湘科計(jì)字[2014]5號(hào))。

趙飛駿(E-mail: hengyangzhfj@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.041

R759.1

A

1002-266X(2016)16-0106-04

2015-10-20)