余文珍陳 實張永亮涂春香陳 勇（福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福州，350；廈門大學附屬福州市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福州，350007）

?

活血化瘀法對鼠頸動脈粥樣硬化損傷血管wnt／β-catenin信號通路的影響

余文珍1陳 實2張永亮2涂春香1陳 勇1
（1福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福州，350122；2廈門大學附屬福州市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福州，350007）

摘要目的：觀察活血化瘀法對頸動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷模型大鼠wnt／β-catenin信號通路的影響，探討其可能的作用機制。方法：32只SD大鼠高脂喂養(yǎng)1個月后，隨機取8只作為假手術(shù)組（僅切開皮膚），其余大鼠均行頸總動脈球囊損傷術(shù)，成膜后再隨機分為模型組（n＝8只）、活血化瘀中藥方中劑量（臨床等效量）組（n＝8只）和高劑量（臨床2倍量）組（n＝8只）。從術(shù)后第4天開始予以相應藥物灌胃治療（模型組、假手術(shù)組灌等量生理鹽水），2周后取術(shù)側(cè)頸總動脈段，采用實時熒光定量PCR法撿測wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA基因表達水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組wnt、FzD1、AXIN1、β-catenin、VEGF等mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01），經(jīng)活血化瘀中藥方干預后，上述各基因mRNA水平均有不同程度升高，尤其是高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05～0. 01）；只有GSK-3βmRNA水平各組無明顯差異。結(jié)論：活血化瘀法可通過上調(diào)wnt／β-catenin信號通路表達，使損傷血管VEGFmRNA基因表達水平上升，提示該法可保護頸動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷。

關(guān)鍵詞活血化瘀法；頸動脈粥樣硬化；血管損傷；wnt／β-catenin信號通路

Effect of Activating Blood and Resolving Stasis Therapy on Injuried Vascular wnt／β-catenin Signal Pathway of Rats with Carotid Atherosclerosis

Yu Wenzhen1，Chen Shi2，Zhang Yongliang2，Tu Chunxiang1，Chen Yong1
（1 College of Integrated Traditional and Western Medicine，F(xiàn)ujian University of TCM，F(xiàn)uzhou 350122，China；2 Department of Neurosurgery，Second Hospital Affiliated to Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350007，China）

Abstract Objective：To observe the effect of activating blood and resolving stasis on injuried vascular wnt／β-catenin in carotid atherosclerosis mode rats and its possible mechanism. Methods：After one-month high fat-diet，32 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，middle dose（dose in clinical equivalent）group and high dose of（2 times the amount of clinical）group. Except for the sham operation group，the other rats underwent carotid artery balloon injury surgery. After 3 days of intraperitoneally administered orally，model group and sham operation group were given equal volume of physiological saline，administered continuously for 14d. Then the expression of wnt，F(xiàn)zD1，AXIN1，GSK-3β，β-catenin，VEGF mRNA in injured vascular were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR in all groups. Results：Compared with the sham operation group，the expression of Wnt，F(xiàn)zD1，AXIN1，β-catenin，and VEGF mRNA levels in model group decreased（P＜0. 01）；and after treated by activing blood and resolving stasis therapy，the expression of the above genes increased in different degrees，especially in the high dose group（P＜0. 01～0. 05）；but there was no significant difference among groups on the expression of GSK-3β mRNA. Conclusion：The theapy of activating blood and resloving stasis therapy can increase the expression of VEGF mRNA of balloon injured carotid artery vascular through up-regulating wnt／β-catenin signal pathway，which suggested that it can protect the injured vascular of carotid atherosclerosis.

Key Words Activating blood and resolving stasis therapy；Carotid atherosclerosis；Injuried vascular；wnt／β-catenin signal pathway

目前我國心腦血管疾病呈高發(fā)上升趨勢，其中動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是其主要的病理學基礎。研究表明，血管內(nèi)皮細胞（Vascular Endothelial Cells，VECs）損傷是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)或關(guān)鍵因素［1-2］。因此，保護VECs及其功能對預防和治療AS具有重要意義。而AS與傳統(tǒng)醫(yī)學的“血瘀”表現(xiàn)極為相似，活血化瘀中藥在臨床中大量應用，對其機制研究表明［3-4］，活血化瘀中藥具有調(diào)脂、抗炎、抗氧化、保護內(nèi)皮等作用進而起到抗AS。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，具活血化瘀功效的中藥方能有效修復損傷的血管內(nèi)皮，為進一步探討其分子機制，本研究以頸動脈球囊損傷大鼠為模型，研究活血化瘀法對損傷血管內(nèi)皮Wnt／β-catenin經(jīng)典信號通路上相關(guān)信號分子表達的影響，如wnt、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）、β-catenin及下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，探討其修復損傷血管內(nèi)皮的作用機制，為活血化瘀法防治AS提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠32只，體重（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司（SCXK（滬）2007-0005）。

1. 2 中藥與試劑、儀器 中藥方組成：桃仁12 g、紅花9 g、當歸9 g、生地黃9 g、牛膝9 g、川芎6 g等（從福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂醫(yī)院中藥房購得）。中藥預先浸泡30 min，后水煎3次，再合并水煎液，于水浴鍋中濃縮成含生藥量2 g／mL，分裝凍存?zhèn)溆?。膽固醇（批號?0111108），購自上?；菖d生化試劑有限公司產(chǎn)品；膽酸鈉（批號：20110508），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。PCR引物，生工生物工程（上海）有限公司合成。手術(shù)顯微鏡（美國world precision instruments）。PCR儀（ABI 7500型）。

1. 3 實驗分組及治療 大鼠予以高脂飼料（自制，配方如下：25%豬油，2%膽固醇，0. 1%膽酸鈉，72. 9%基礎飼料）喂養(yǎng)1個月后，隨機取8只作為假手術(shù)組（僅切開頸部皮膚）（A組）；余下均行頸動脈球囊損傷術(shù)，再隨機分為模型組（B組，n＝8只）、中藥方中劑量（臨床等效量）（C組，n＝8只）和高劑量（臨床2倍量）（D組，n＝8只）。并于術(shù)后第4天開始予以相應藥物灌胃治療（模型組、假手術(shù)組予等量生理鹽水），2周后禁食不禁水處死大鼠，取術(shù)側(cè)頸總動脈段，迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移保存在-70℃冰箱中備用。注：大鼠頸動脈球囊損傷模型制備參照David Anthony等［5］方法稍進行改良。術(shù)后在水瓶中加入芐星青霉素以通過飲水預防感染，并單籠喂養(yǎng)。另外因未找到合適西藥，故未設陽性對照組。

1. 4 實時熒光定量PCR法檢測各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA的表達 按Trizol法提取各組大鼠頸動脈總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄擴增試劑盒操作程序進行cDNA合成。擴增條件為：95℃，2 min變性，95℃，10 s，60℃，30 s，70℃，30 s，擴增40個循環(huán)，獲得各樣本待測基因的CT值，各組間相對基因表達用2-△△CT表示［△△CT＝AVERAGE（樣本CT值）-AVERAGE（內(nèi)參CT值）］。采用ACTB作為內(nèi)參照，所用引物序列見表1。

1. 5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17. 0軟件進行處理，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)值均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0. 05代表有統(tǒng)計學意義。

表1　實時熒光定量PCR引物

2　結(jié)果

2. 1 大鼠一般情況觀察 假手術(shù)組大鼠未見有明顯異常改變。模型組大鼠術(shù)后前3 d大鼠精神較差，后稍有好轉(zhuǎn)，但毛發(fā)欠光澤，體重增長緩慢，未見感染死亡現(xiàn)象。中藥方治療組大鼠較模型組大鼠毛色光澤，活動度較好。

2. 2 各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA的表達比較 用QPCR方法檢測上述基因表達，結(jié)果顯示各引物溶解曲線（圖1）均呈現(xiàn)單峰，說明其具有較強的特異性。每個樣品擴增曲線（圖2）呈S形，CT值≤30，均陽性，拋物線平滑，基線平坦，并經(jīng)指數(shù)擴增期依次達平臺期，用2-△△Ct方法分析統(tǒng)計相對表達值。定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，模型組wnt、FzD1、AXIN1、β-catenin、VEGF等mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01），藥物干預后，上述各基因mRNA水平均有不同程度升高，尤其是高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05～0. 01）；只有GSK-3βmRNA水平各組無明顯差異。（圖1、圖2，表2）

3　討論

圖1　相關(guān)基因溶解曲線

圖2　相關(guān)基因擴增曲線

表2　各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA相對表達比較（±s）

表2　各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA相對表達比較（±s）

注：與A組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與B組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　　假手術(shù)組（A）　　模型組（B）　　中藥中劑量組（C）　　中藥高劑量組（D）只數(shù)8888 wnt　1. 0000±0. 1442　0. 3191±0. 0464**　0. 7239±0. 0940**△△　0. 4493±0. 0403**△△FzD1　1. 0000±0. 1792　0. 0065±0. 0004**　0. 0226±0. 0014**　0. 1238±0. 0099**△AXIN1　1. 0000±0. 0791　0. 0208±0. 0014**　0. 2799±0. 0365**△△　0. 6699±0. 0357**△△GSK-3β　1. 0000±0. 0815　1. 0269±0. 0975　0. 9833±0. 1122　0. 9731±0. 0732 β-catenin　1. 000±0. 1402　0. 7843±0. 0471**　0. 8482±0. 0942**　0. 9539±0. 0894△△VEGF　1. 0000±0. 0425　0. 4304±0. 0354**　0. 6072±0. 0457**△△　0. 7407±0. 0710**△△

中醫(yī)學認為“久病必有瘀，怪病必有瘀”，而AS的發(fā)生是一個長期的過程，最終導致臟腑功能失調(diào)，故而治療上當以活血化瘀為主［6-7］。田金洲等對腦梗死患者進行中醫(yī)證候分析，發(fā)現(xiàn)分型屬血瘀證的患者中有78. 6%頸動脈超聲檢查有頸動脈斑塊，而無血瘀證的只有57. 4%有頸動脈斑塊，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05）；經(jīng)統(tǒng)計分析認為頸動脈粥樣硬化和血瘀證成正相關(guān)性［8］。故而本課題采用活血化瘀中藥方干預頸動脈粥樣硬化。

內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血管壁的生物屏障，在AS病變的發(fā)生上有重大意義［9］。而一般認為頸動脈粥樣硬化較冠狀動脈粥樣硬化要早，與主動脈硬化大約同時進行，它是腦血管病重要的危險因素之一［10］。頸動脈粥樣硬化的治療方法有頸內(nèi)動脈切除術(shù)（CEA）、頸動脈血管成形支架置入術(shù)（CAS）、經(jīng)皮腔內(nèi)動脈成形術(shù)（PTA）等［11］。這些治療方法均有可能損傷血管內(nèi)皮，引起內(nèi)皮細胞功能紊亂。本研究采用的動物模型是先高脂喂養(yǎng)以造成血脂升高，后借助球囊損傷血管以模擬頸動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷進而導致功能紊亂。Wnt／β-catenin信號通路在正常細胞中無激活，在生物進化中極為保守，其異常表達與人類疾病關(guān)系密切［12-13］。目前研究表明血管發(fā)生與Wnt／β-catenin信號通路有著密切的聯(lián)系，該信號通路可能成為未來血管內(nèi)皮細胞相關(guān)疾病治療的新靶點［14-15］。Wnt／β-catenin信號通路可以分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型途徑。經(jīng)典Wnt蛋白（含Wnt1、Wnt3A和Wnt8等）與膜受體卷曲蛋白（Frizzled）結(jié)合，從而抑制Gsk-3β與Axin的表達，降低β-catenin的磷酸化［16］。β-catenin是一種多功能蛋白，可以作為血管內(nèi)皮和N-鈣粘素和肌動蛋白細胞骨架之間的支架，在存在Wnt配體時，可使其穩(wěn)定并轉(zhuǎn)位到細胞核以促進轉(zhuǎn)錄，激活靶基因VEGF等轉(zhuǎn)錄，控制血管穩(wěn)定性［17-19］。

本實驗結(jié)果表明，球囊損傷大鼠血管wnt配體（wnt1）、wnt受體（FzD1）、Axin及β-catenin mRNA表達水平均較正常血管下降；經(jīng)活血化瘀中藥方干預后，模型大鼠損傷血管上述基因表達水平均有不同程度升高，特別是高劑量組，與模型組比較有顯著促進作用（P＜0. 05～0. 01），表明其具有一定的劑量依賴性。Gsk-3β蛋白是Wnt／β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，起負性調(diào)控作用，其可調(diào)節(jié)β-catenin進入細胞核的量，防止細胞功能出現(xiàn)異常［20］。本研究結(jié)果顯示在Gsk-3β基因表達水平方面各組差異無統(tǒng)計學意義，提示該模型Gsk-3β基因未出現(xiàn)表達異常。VEGF與血管內(nèi)皮特異性受體結(jié)合后，可促進血管內(nèi)皮細胞進行有絲分裂，導致內(nèi)皮細胞增生，形成新生血管［21］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，活血化瘀中藥方能促進VEGF基因的表達，提示其具有修復損傷血管的作用，這可能與促進上述wnt／β-catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子的表達有關(guān)。

參考文獻

［1］Tomczyk M，Nowak W，Jazwa A. Endothelium in physiology and pathogenesis of diseases［J］. Postepy biochem，2013，59（4）：357-364.

［2］田海濤，曹芳英，朱智明，等.心血管疾病不容忽視的問題：血管內(nèi)皮細胞損傷［J］.轉(zhuǎn)化醫(yī)學雜志，2013，2（3）：173-177.

［3］盛松，徐鳳芹.活血化瘀中藥抗動脈粥樣硬化的作用機制研究進展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11（5）：591-592.

［4］王景尚，黃燁.活血化瘀中藥干預動脈粥樣硬化作用機制的研究進展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11（12）：1501-1503.

［5］David Anthony Tulis，M. S.，Ph. D.，F(xiàn). A. H. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid artery balloon injury studies［J］. Methods Mol Med，2007，139：31-66.

［6］曹田梅，張李興，顏新.化瘀法探源及國醫(yī)大師顏德馨對活血化瘀理論的創(chuàng)新貢獻［J］.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23（5）：292-294.

［7］張磊，顏新.國醫(yī)大師顏德馨治療心系疾病氣血精神層次用藥分析［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2014，30（4）：625-627.

［8］田金洲，時晶，倪敬年，等.腦梗塞患者頸動脈斑塊與血瘀證的相關(guān)性研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（3）：149-152.

［9］Antohe F. Endothelial cells and macrophages，partners in atherosclerotic plaque progression［J］. Arch Physiol Biochem，2006，112（45）：245-253.

［10］繆惠寧，王艷飛，王雨水，等.冠心病患者冠狀動脈粥樣硬化程度與頸動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究［J］.中國心血管病研究雜志，2014，12（10）：911-914.

［11］朱健，陳吉祥，郭大喬.顱外段頸動脈狹窄的治療策略［J］.中國微創(chuàng)外科雜志，2014，14（11）：1005-1007.

［12］Clevers H，Nusse R. Wnt／β-catenin signaling and disease［J］. Cell，2012，149（6）：1192-205.

［13］Roderick J. Tan，Dong Zhou，Lili Zhou，et al. Wnt／β-catenin signaling and kidney fibrosis［J］. Kidney international supplements，2014，4（1）：84-90.

［14］程華，孫芳玲，艾厚喜，等. Wnt信號通路與血管發(fā)生研究進展［J］.神經(jīng)藥理學報，2011，1（6）：60-63.

［15］Birdsey GM，Shah AV，Dufton N，et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt／βcatenin signaling［J］. Dev Cell，2015，32（1）：82-96.

［16］Dawson K，Aflaki M，Nattel S. Role of the Wnt-Frizzled system in cardiac pathophysiology：a rapidly developing，poorly understood area with enormous potential［J］. J Physiol，2013，591（6）：1409-1432.

［17］Birdsey GM，Shah AV，Dufton N，et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt／βcatenin signaling［J］. Dev Cell，2015，32（1）：82-96.

［18］Reis M，Liebner S. Wnt signaling in the vasculature［J］. Exp. Cell Res.，2013，319（9）：1317-1323.

［19］Dejana E. The role of wnt signaling in physiological and pathological angiogenesis［J］. Circ. Res.，2010，107（8）：943-952.

［20］Maiese Kenneth，Li Faqi，Chong Zhaozhong，et al. The Wnt signaling pathway：aging gracefully as a protectionist？［J］. Pharmacology and Therapeutics，2008，118（2）：58-81.

［21］Hagedom M，Balke M，Schmidt A，et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis［J］. Dev Dyn，2004，230（1）：23-33.

（2015 -07 -10收稿 責任編輯：王明）

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 034

作者簡介：余文珍（1977. 01—），女，碩士，副教授，研究方向：代謝性疾病研究，E-mail：110035632＠qq. com

基金項目：福建省教育廳A類科技項目（編號：JA13165）；福州市科技計劃項目（編號：2012-S-155-1）；福建中醫(yī)藥大學校管科研項目（編號：X2012018）