張 忠，張勁松，2，3，劉艷芳，周 帥，王金艷，2，于華崢，3，唐慶九，2*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海201403；2上海海洋大學食品學院，上海201306；3上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

?

分光光度法測定靈芝中總三萜含量方法探討

張 忠1，張勁松1，2，3，劉艷芳1，周 帥1，王金艷1，2，于華崢1，3，唐慶九1，2*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海201403；2上海海洋大學食品學院，上海201306；3上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

摘 要：分別運用分光光度法和HPLC法測定了靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中三萜含量，發(fā)現(xiàn)不同方法所測得的含量差別較大。對不同的靈芝酸標準品及干擾物質油酸、麥角甾醇進行香草醛高氯酸的顯色反應，發(fā)現(xiàn)不同的靈芝酸顯色后最佳吸收波長在530—550 nm，在550 nm處的測定值相差很大，特別是靈芝中含量較高的靈芝酸A、B和C的測定值嚴重偏低，而干擾物質油酸和麥角甾醇對測定值具有嚴重的干擾。試驗結果表明：采用分光光度法測定靈芝中總三萜的含量不能如實反應靈芝中總三萜的實際情況，不建議作為測定靈芝及其相關產(chǎn)品中總三萜含量的方法。

關鍵詞：靈芝；三萜；分光光度法；HPLC

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，靈芝中含有多種化學成分，包括多糖、三萜、甾醇、生物堿等［1］。其中三萜類化合物是靈芝的主要活性成分之一，具有護肝排毒、抗氧化、抑制腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等藥理活性［2-5］，因此三萜化合物含量的高低是靈芝產(chǎn)品品質的重要指標。

目前，靈芝及其產(chǎn)品中總三萜含量的定量檢測還沒有統(tǒng)一的國家標準；農(nóng)業(yè)部在2001年頒布了檢測靈芝及其相關產(chǎn)品中總三萜含量的備案標準（NY/SJ 339—2001）［6］；該標準主要是以齊墩果酸或熊果酸為對照品，以5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸為顯色劑，用分光光度法測定靈芝中總三萜的含量。該標準所采用的方法是目前最常用的檢測方法之一，但由于靈芝中干擾物質多，因此測定結果誤差大，同時標準品齊墩果酸與靈芝中三萜成分結構差異較大，作為指標成分是否合適有待商榷。近年來，有很多學者對此方法進行了優(yōu)化，如王紅梅等［7］對標準溶液濃度、取樣體積、顯色劑的用量等方面進行優(yōu)化來測定靈芝孢子粉中總三萜的含量；李保明等［8］選用靈芝中的成分靈芝酸B為對照品，采用比色法測定靈芝總三萜酸含量。

1 材料與方法

1．1 原料

靈芝子實體及孢子粉（菌株號G0109）來自浙江龍泉靈芝栽培基地；靈芝菌絲體為上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所菌株G0109液體發(fā)酵所得。

1．2 試劑與儀器

齊墩果酸（標準品），中國藥品生物制品檢定所；色譜級甲醇，美國迪馬科技公司；分析純無水乙醇、分析純高氯酸、香草醛、冰醋酸，國藥集團藥業(yè)股份有限公司；油酸，sigma公司；靈芝酸A等標樣由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供（分離純化所得，純度大于99％）。

齊墩果酸標準溶液：精確稱取干燥至恒重的齊墩果酸10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準溶液；5％香草醛-冰醋酸溶液：稱取香草醛5 g，加入95 mL冰醋酸溶解即可。

離心機，德國Heraeus公司；超聲波清洗器K1-250DE，昆山市超聲儀器有限公司；Waters 600高效液相色譜儀（2996型二極管陣列檢測器），美國Waters公司；安捷倫8453型紫外可見分光儀，美國安捷倫公司；Synergy HT96孔板酶標儀，Bio-TEK公司。

1．3 靈芝子實體、菌絲體、孢子粉樣品液的制備

從那件事情以后我再也沒有哭過，媽媽和弟弟說我終于像個男子漢了，我聽后，心里甭提有多高興了。（指導老師：孫玉巧）

樣品靈芝子實體置于烘箱65℃干燥24 h后，經(jīng)粉碎機粉碎成碎屑。分別準確稱取200" 00 mg靈芝子實體碎屑、菌絲體、孢子粉、破壁孢子粉各3份置于50 mL離心管中，加入95％乙醇10 mL，充分混勻，靜置6 h，室溫超聲30 min，過濾；濾渣再分別加入95％乙醇10 mL，充分混勻，靜置6 h，室溫超聲30 min，過濾，合并濾液待用。

1．4 齊墩果酸標準曲線的繪制

參照農(nóng)業(yè)部檢測靈芝及其相關產(chǎn)品中總三萜含量的備案標準（NY/SJ 339—2001），準確吸取質量濃度為1 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL分別放入20 mL具塞磨口試管中，將試管置于沸水浴中蒸發(fā)去溶劑，然后在每個試管中加入0" 20 mL 5％香草醛-冰醋酸溶液和1"0 mL高氯酸，加塞搖勻。置于60℃水浴恒溫加熱20 min并移入冰水浴冷卻3 min，再加入5" 0 mL冰醋酸，搖勻并置于室溫，15 min后于550 nm處測定對照品溶液的吸光度值。以吸光度值為橫坐標、齊墩果酸質量（μg）為縱坐標作圖，得標準曲線。

1．5 分光光度法測定靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中的總三萜含量

靈芝子實體、菌絲體、孢子粉樣品液（1" 3所制備）參照1" 4方法測定吸光度值，對照齊墩果酸標準曲線，計算總三萜含量。

1．6 高效液相色譜法（HPLC）測定靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中的三萜含量

1" 6" 1 高效液相色譜法（HPLC）的測定條件

參照文獻［14］色譜條件，色譜柱為YMC ODS-A（250 mm×4" 6 mm），柱溫30℃，5‰醋酸水（A）與甲醇（B）梯度洗脫：0 min，A：70％，B：30％；50 min，A：60％，B：40％；85 min，A：0％，B：100％；100 min，A：100％，B：0％；110 min，A：70％，B：30％；流速1" 0 mL/min，進樣量10 μL，檢測時間110 min，檢測波長：3D波長掃描，210—400 nm。

1" 6" 2 對照品溶液的制備

準確稱取1" 0 mg的靈芝酸A、B、C2、DM、S、T、靈芝酮三醇、靈芝醇B標準樣品于2 mL離心管中，加入1" 0 mL甲醇（色譜純）配成1" 0 mg/mL的對照品溶液待用。

1" 6" 3 HPLC法測定靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中的三萜含量

參照1" 3方法制備靈芝子實體、菌絲體、孢子粉樣品液，采用1" 6" 1方法測定其三萜含量。

1．7 靈芝酸A等8個標準品以及油酸和麥角甾醇最佳吸收波長的確定

準確吸取質量濃度為1 mg/mL的靈芝酸A、B、C2、DM、S、T、靈芝酮三醇、靈芝醇B標準樣品溶液和油酸與麥角甾醇樣品液各50 μL放入20 mL具塞磨口試管中，將試管置于沸水浴中蒸發(fā)去溶劑，分別加入0" 20 mL 5％香草醛-冰醋酸溶液和1" 0 mL高氯酸，加塞搖勻。置于60℃水浴恒溫加熱20 min并移入冰水浴冷卻3 min，再加入5" 0 mL冰醋酸，搖勻并置于室溫，15 min后用酶標儀于400—700 nm掃描測定對照品溶液的吸光度值。

2 結果與分析

2．1 分光光度法測定靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中的總三萜含量

試驗結果表明：靈芝破壁孢子粉中三萜含量最高，為1" 93％；靈芝子實體中三萜含量為1" 42％；菌絲體為0" 85％；孢子粉未破壁含量較低，為0" 04％。

2．2 HPLC法測定靈芝子實體、菌絲體、孢子粉中的三萜含量

如圖1所示，靈芝子實體中三萜峰種類多，并含有酸性三萜和中性三萜；靈芝菌絲體中三萜含量較少，出峰時間基本在60 min后，主要是極性較低的中性三萜；而用分光光度法測定三萜含量很高的靈芝破壁孢子粉，在HPLC圖譜中基本看不到峰。因此，分光光度法與HPLC法測定的結果完全不一致，特別是靈芝孢子粉中的三萜含量相差非常大。

圖1　HPLC法測定靈芝各樣品中總三萜含量Fig．1 Total triterpenoid content in Ganoderma lucidum by HPLC

2．3 靈芝酸A等對照品溶液最佳吸收波長的確定

為探討兩種方法為何有如此大的差別，分別將靈芝中所含的8種靈芝標準品與香草醛高氯酸反應，并進行紫外掃描，結果顯示幾種靈芝酸都可以與香草醛高氯酸產(chǎn)生顏色反應，其最佳吸收波長在530—550 nm（圖2）。靈芝酸S的最佳吸收波長為550 nm，與齊墩果酸的最佳吸收波長相同；靈芝酸A、B、C2、DM、T的最佳吸收波長同為532 nm，靈芝酮三醇的最佳吸收波長為542 nm。同時試驗還對靈芝中干擾物質油酸和麥角甾醇進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)干擾物質麥角甾醇最佳吸收峰為542 nm，油酸的最佳吸收峰為522 nm和596 nm。因此，三萜測定所用波長為550 nm時，測定值與真實值會有一定的偏差。

圖2　靈芝酸等對照品溶液最佳吸收波長Fig．2 The optimal absorption wavelengths of Ganoderma lucidum acids

2．4 靈芝酸A等8個標準品以及油酸和麥角甾醇與齊墩果酸對照品溶液顯色比較和測定值比較

為了解不同的標準品與香草醛高氯酸反應后的偏差，取同樣濃度的標準品及干擾物質各50 μg加入顯色劑和高氯酸后，各樣品液顯色如圖3所示，可以看出靈芝酸A、B、C2、DM、T樣品液顯較淺顏色，與齊墩果酸顏色相差大；靈芝酸S、靈芝酮三醇、靈芝醇樣品液顏色較深，與齊墩果酸同濃度樣品液比色相差很小；而干擾物質油酸顏色偏紅，麥角甾醇樣品液顏色也較深。

圖3　靈芝酸等對照品溶液顯色比較及測定值與實際值比較Fig．3 Color reaction and comparison of measured value and actual value of Ganoderma lucidum acids

550 nm下測定各樣品液吸光度值，以齊墩果酸為標準品來計算50 μg靈芝酸標準品及干擾物的實測值，結果如圖3所示，測定值與真實值所含三萜相差較大的為靈芝酸A、B、C2、DM、T；特別是靈芝中含量較高的靈芝酸A，測定值（1" 69 μg）只有真實含量（50 μg）的1/30，相差最大的靈芝酸DM的實際值（50 μg）是測定值（0" 97 μg）的51" 55倍。同時發(fā)現(xiàn)干擾物質的測定值較高，麥角甾醇的測定值已超過真實量的50％，而油酸的干擾也達到40％以上。

3 討論

分光光度法與HPLC法分別測定靈芝子實體、孢子粉及菌絲體中三萜含量結果完全不一致，為探討其原因，以齊墩果酸作為對照品，對不同的靈芝酸標準品進行測定值與真實值的比較，發(fā)現(xiàn)靈芝子實體中大量含有的靈芝酸A、B、C2等的含量被嚴重低估，而靈芝子實體和孢子油中所含的化學成分油酸和麥角甾醇則嚴重干擾測定結果。

靈芝子實體產(chǎn)量越來越大，用于保健產(chǎn)品中越來越多，如何控制靈芝及其提取物的質量，運用合適的測定方法十分重要。靈芝子實體中以酸性三萜為主，特別是靈芝酸A的含量較高，但如果用分光光度法進行測定，靈芝酸A的結果會嚴重偏低；而靈芝中也含有麥角甾醇，含量達到0" 24％［11］，甾醇及其類似物會干擾測定結果，使得測定值偏高。因此，運用分光光度法測定的結果不能如實反應靈芝中總三萜的含量，分光光度法不適合用于靈芝子實體及其提取物或產(chǎn)品的分析測定。

通過HPLC法發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉中基本沒有三萜，但運用分光光度法可以測定出結果為2％左右，而孢子粉的升級產(chǎn)品孢子油同樣用HPLC法測定不出三萜，而用分光光度法測定出結果高達10％，其主要原因是靈芝孢子粉中含有大量的油酸、亞油酸、麥角甾醇等干擾物質，香草醛高氯酸顯色法沒有特異性，不能區(qū)分干擾物質和三萜，運用分光光度法測定的結果基本都是干擾物質顯色的結果。本試驗表明，分光光度法不適合作為測定靈芝孢子粉及孢子油中三萜含量的方法。

參 考 文 獻

［1］林志彬"靈芝的現(xiàn)代研究［M］"北京：北京醫(yī)科大學出版社，2001：158"

［2］Carmen W H，Xin D" Chromatographic and dectrophorefie methods for Lingzhi pharmacologically active components［J］" J" Chromatogr" B，2004，812（1/2）：241-257"

［3］Lin C N，Tomp W P" Novel cytotoxic principles of Formosan Ganoderma lucidum［J］" J Nat Prod，1991，54（4）：998-1002"

［4］Min B S，Gao J J，Nakamura N，et al" Triterpenes from the Meth-A and LLC tumor cells［J］" Chem Pharm Bull，2000，48（7）：1026-1033"

［5］Li C H，Chen P Y，Chang U M，et al" Ganodericacid X，a lanostanoid triterpene inhibits topoisomerases and induces apoptosis of cancer cells ［J］" Life Sciences，2005，77：252-265"

［6］農(nóng)業(yè)部食用菌產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心"農(nóng)業(yè)部備案標準NY/SJ 339—2001：靈芝三萜含量的測定［S］"北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001"

［7］王紅梅，劉海燕，林淼，等，靈芝孢子粉中總三萜含量標準測定方法的改進［J］"食用菌學報，2013，20（2）：42-45"

［8］李保明，劉超，王洪慶，等"靈芝總三萜酸含量測定方法的研究［J］"中國中藥雜志，2012，32（12）：1234-1236"

［9］農(nóng)業(yè)部食用菌產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心（上海）"農(nóng)業(yè)部備案標準NY/T 2278—2012：靈芝產(chǎn)品中靈芝酸含量的測定高效液相色譜法［S］"北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013"

［10］胡居吾，范青生，肖小年"菌草靈芝孢子油與段木靈芝孢子油中脂肪酸組成的比較研究［J］"天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）：606-608"

［11］劉京晶，黃文華，呂明亮，等" HPLC法測定不同品種及段木栽培靈芝子實體中麥角甾醇含量［J］"中藥材，2011，34（2）：187-190"

［12］張曉琦，龐國亮，程燕，等"赤芝孢子的三萜和甾體類成分研究［J］"中藥材，2008，31（1）：41-44"

［13］張麗，王瑜杰，丁安偉" HPLC法測定靈芝孢子油中麥角甾醇的含量［J］"江蘇中醫(yī)藥，2009，41（6）：42-43"

［14］章慧，張勁松，賈薇，等"超臨界CO2萃取靈芝子實體三萜工藝優(yōu)化及其與醇提法比較研究［J］"食用菌學報，2011，18（3）：74-78"

（責任編輯：閆其濤）

Discussion on the determination of total triterpenoids in Ganoderma lucidum by spectrophotometry

ZHANG Zhong1，ZHANG Jing-song1，2，3，LIU Yan-fang1，ZHOU Shuai1，WANG Jin-yan1，2，YU Hua-zheng1，3，TANG Qing-jiu1，2*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；National Engineering Research Center of Edible Fungi；Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，Shanghai 201403，China；2College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3School of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：Total triterpenoid content in fruit body，mycelium and spore powder of Ganoderma lucidum were determined by spectrophotometry and HPLC respectively，which showed that total triterpenoid content measured by different methods was quite different" The color reaction results of vanillin perchloric acid with different Ganoderma lucidum acid standard and oleic acid，ergosterol showed that the optimal absorption wavelengths of different Ganoderma lucidum acids are 530—550 nm" The measured value at 550 nm was quite different，especially the determination values of Ganoderma lucidum acid A，B and C with high content were seriously low，and the interfering substances of oleic acid and ergosterol had serious interference on the determination value" The results show that the determination value of total triterpene content in Ganoderma lucidum by spectrophotometry could not accurately reveal the actual total triterpene content of Ganoderma lucidum，which was not suitable for the determination of total triterpene content of Ganoderma lucidum"

Key words：Ganoderma lucidum；Triterpenoids；Spectrophotometry；HPLC

*通信作者：唐慶九（1969—），女，博士，研究員，主要從事食藥用菌的研究與產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：tangqingjiu＠saas" sh" cn

作者簡介：張忠（1983—），男，碩士，助理研究員，主要從事食藥用菌活性物質的研究與產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：zhangzhong＠saas" sh" cn

基金項目：國家科技支撐計劃子課題［食用菌功能因子提取制備及產(chǎn)品開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化（2013BAD16B08-02）］；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項子課題［食用菌副產(chǎn)物中活性物質提取及富集技術研究與示范（201303080）］

收稿日期：2014-11-05

文章編號：1000-3924（2016）01-061-05

中圖分類號：S567" 3

文獻標識碼：A