任目瑾，周建峰

(陜西省苗木繁育中心，陜西 眉縣 722305)

植物組織培養(yǎng)的常見污染及其防控技術(shù)

任目瑾，周建峰

(陜西省苗木繁育中心，陜西 眉縣 722305)

在分析植物組織培養(yǎng)污染分類、污染原因基礎(chǔ)上，提出了外殖體選擇、采集、預(yù)培養(yǎng)、清洗消毒等外植體污染防控措施，熏蒸消毒、紫外燈照射滅菌、設(shè)備器械消毒等環(huán)境污染防控措施，操作人員衛(wèi)生、操作規(guī)程執(zhí)行等操作污染防控措施。

植物；組織培養(yǎng)；污染；管理

植物組織培養(yǎng)是利用細(xì)胞的全能性通過無菌操作把植物體的外植體接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)的一套技術(shù)和方法。隨著科技的發(fā)展，這項技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于植物快繁、種質(zhì)保存和遺傳改良。植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下進(jìn)行的，盡管各個環(huán)節(jié)的操作有嚴(yán)格的要求，但是污染還是經(jīng)常發(fā)生，甚至影響到實驗的成敗和規(guī)模化生產(chǎn)。污染的出現(xiàn)增加了成本，浪費(fèi)了資源，延誤了時間，影響了工作效率。因此，分析植物組織培養(yǎng)中的污染種類，提出相應(yīng)防控措施，對這項技術(shù)的推廣利用具有重要意義。

1 污染分類

污染是指在培養(yǎng)過程中由于外界真菌、細(xì)菌或培養(yǎng)材料的內(nèi)生菌所侵染，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。按污染種類分為細(xì)菌污染、真菌污染和病毒污染。

細(xì)菌是所有微生物中數(shù)量最多的一類，無孔不入，泥土里、水里、空氣里都散布著細(xì)菌，或者與其他生物共生，形狀各異，大小不一。細(xì)菌污染的特點是在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或者是渾濁的水跡狀，有時甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀，一般在接種1～2d即能發(fā)現(xiàn)，菌落小，表面呈乳脂狀光澤，一般有臭味。細(xì)菌污染主要來源于接種材料及工具。細(xì)菌污染占52.13%[1]，通常有球菌和芽孢桿菌等[2]。

真菌喜歡溫暖潮濕的環(huán)境。真菌污染的特點是菌斑呈絨毛狀、絮狀，界限不明顯，伴有不同顏色的孢子，一般在接種3～10d后才能發(fā)現(xiàn)，菌落大，顏色多樣，表面呈毛絨狀，一般有霉味。真菌的污染主要來源于環(huán)境。真菌中通常有青霉菌、芽枝霉菌、黑曲菌和酵母菌等[2]。

病毒顆粒特別微小，所以病毒污染的概率比較小。病毒肉眼看不到，污染難于發(fā)現(xiàn)，用電子顯微鏡才能觀察到。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對整個細(xì)胞培養(yǎng)不會致死。多數(shù)病毒來源于外植體本身。

2 污染原因

組織培養(yǎng)中的污染原因很多，主要有外植體污染，外植體消毒不過關(guān)，組織培養(yǎng)中的設(shè)備、儀器、工具消毒滅菌不徹底，接種環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境不清潔[3]，操作人員衛(wèi)生習(xí)慣不良，不能對原瓶苗污染情況仔細(xì)辨認(rèn)，培養(yǎng)材料攜帶內(nèi)生菌；不能嚴(yán)格地執(zhí)行消毒流程等等。

3 污染的防控措施

3.1 外植體的污染

3.1.1 外殖體的選擇和采集 為減少外植體污染，要從外植體采集源頭注意防控，不同環(huán)境下的外植體其帶菌程度不同。分生組織生長快，細(xì)菌幾乎來不及感染，因此挽救瀕臨的植物、需要脫毒的植物都采用分生組織進(jìn)行組織培養(yǎng)，可大大較少污染。一般情況下外植體的采集時間選擇在春季晴天的中午，盡可能選擇溫室內(nèi)的植株或新生嫩芽。因為春季萬物復(fù)蘇，蘊(yùn)藏了一冬的新芽開始萌發(fā)，比其它任何季節(jié)污染都少，晴天陽光可以殺死一部分細(xì)菌，下雨天濕度大，植株上殘留水分多，污染幾率大，溫室內(nèi)植物比露天植物帶菌少，新生嫩芽比老芽裸露時間短，帶菌少。另外采集前人手、工具、用具必須用75%的酒精進(jìn)行消毒，以免產(chǎn)生污染。

3.1.2 外植體的預(yù)培養(yǎng) 如果室外栽培的材料污染太嚴(yán)重，可先將植物樣本挖出，改為室內(nèi)盆栽，種植到蛭石或珍珠巖中，按要求控制生長，可使用抗生素，不要施肥，澆水時水不能濺到葉片上，保持稍強(qiáng)光照(不灼燒葉片為宜)，濕度保持在50%～60%的環(huán)境，待抽出新芽，有條件的進(jìn)行細(xì)菌病毒檢測，沒有細(xì)菌的可做為外植體。不便移栽的植株，可套塑料袋，待長出新枝條后，再行采樣。也可將田間采集的枝條用水沖洗干凈后插入無糖的液體培養(yǎng)液或自來水中使其發(fā)枝，以這種新抽的嫩枝作為外植體，可大大減少內(nèi)源菌的污染。

有些植株可進(jìn)行黃化處理，采集田間的枝條放在無菌條件下，進(jìn)行暗培養(yǎng)，待抽出徒長的黃化枝條時取材，可減少污染。

3.1.3 外植體的清洗消毒 外植體表面消毒既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細(xì)胞。外植體采回來后，先用自來水沖掉表面的灰塵和雜物，剪掉不要的枝、葉等組織，放入燒杯中用洗潔精水浸泡3min，再用水沖洗干凈，流水下再沖洗30min。然后帶進(jìn)無菌操作臺，用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗一遍，再用次氯酸鈉、次氯酸鈣或0.1%的升汞浸泡10～30min(視植株品種、幼嫩程度而定)，無菌水再沖洗5遍。升汞的消毒效果是最好的。但應(yīng)當(dāng)記住， 消毒劑是對植物有毒害作用的。應(yīng)正確選擇消毒劑的種類、濃度和處理時間，盡量減輕對外植體的傷害。

3.2 環(huán)境的污染

3.2.1 熏蒸消毒 組織培養(yǎng)室在啟動生產(chǎn)前，進(jìn)行熏蒸處理，甲醛用量4～6ml·m-3,高錳酸鉀3～6g·m-3配比液熏蒸。使用時，先關(guān)閉所有的門窗，分別量取好需要的甲醛和高錳酸鉀，將甲醛溶液倒入裝有高錳酸鉀的容器中，立刻會有煙霧產(chǎn)生，操作人員應(yīng)避開煙霧馬上離開，熏蒸30min即可，將室內(nèi)環(huán)境的真菌減少87%～100%[4]。以后每月一次熏蒸。

3.2.2 紫外燈照射滅菌 培養(yǎng)架保持整潔干凈無雜物，污染物品和污染培養(yǎng)基應(yīng)及時清理出培養(yǎng)室，培養(yǎng)室和接種室每天用次氯酸鈉消毒液進(jìn)行地面消毒，每次接種前要用75%的酒精噴灑室內(nèi)，使灰塵落地，防止微笑塵粒飛揚(yáng)，然后紫外燈照射30min[5]。

3.2.3 設(shè)備器械的消毒 每天使用的工具、用具提前進(jìn)行滅菌處理，操作臺每次使用前用紫外燈照射30min，然后用75%的酒精噴濕脫脂棉擦拭操作臺內(nèi)的各個面，每月更換操作臺上的過濾網(wǎng)，保持操作臺上干凈整潔，不能堆放不需要的物品，長期未使用的操作臺使用前要進(jìn)行徹底清洗消毒，每月用培養(yǎng)皿放培養(yǎng)基檢測操作臺的潔凈度和高壓滅菌鍋的滅菌效果。高壓滅菌鍋如果滅菌不徹底，培養(yǎng)基也會出現(xiàn)污染，除嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程外應(yīng)每月用測試帶檢測滅菌效果。接種用的刀、鑷子、剪刀等一般采用干熱滅菌法,使用前用酒精棉球擦拭,并在火焰上灼燒,然后冷卻備用[6],玻璃器皿、工作服等用濕熱滅菌法，用報紙或棉布包好，放入高壓滅菌鍋，等壓力穩(wěn)定在0.105MPa,溫度為121℃的條件下,維持18～20min,時間,冷卻后備用。

3.3 操作污染的管理

3.3.1 操作人員衛(wèi)生 操作污染控制首先要從工作人員衛(wèi)生入手。操作人員應(yīng)養(yǎng)成常剪指甲、勤洗澡的衛(wèi)生習(xí)慣，進(jìn)入無菌區(qū)不能戴戒指，不能吃東西，不能喝水，不能聽音樂，禁止吸煙，工作服里外要分開，里面的只能在實驗室穿，更衣室保持整潔干凈，每天用消毒水拖地消毒；工作服每周清洗消毒一次，夏季每三天清洗消毒一次，口罩、帽子要非常干凈，一次性用品要及時更換；進(jìn)入無菌室前要用肥皂洗手，換好實驗室的衣服和鞋之后用消毒液對雙手進(jìn)行消毒，進(jìn)入培養(yǎng)室再次用75%的酒精對雙手進(jìn)行消毒。

3.3.2 操作規(guī)程的執(zhí)行 操作污染是組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中最普遍的污染，也是可以控制的污染，操作人員除養(yǎng)成良好地衛(wèi)生習(xí)慣外，還要嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程和消毒流程。

(1) 配制室

每一月重新配制母液和激素，培養(yǎng)基一般提前2天配制，化學(xué)藥品4℃保存，定期檢查pH計、天平、溫度計等、不能使用過期及質(zhì)量不好的藥品，高壓滅菌鍋爐嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。

(2)培養(yǎng)室

溫濕度和光照要控制在適宜的范圍內(nèi)，溫度25±1℃，濕度40%，光照1 500～3 000Lux，按時記錄溫濕度，及時調(diào)整，如果濕度過高，可使用空調(diào)“除濕”功能，保持室內(nèi)濕度適宜，也可減少真菌生長繁殖，濕度過低可采用加濕器進(jìn)行加濕。不定時檢查燈管，及時更換，保證光照強(qiáng)度。

(3)操作室

每天酒精噴灑后，紫外燈消毒30min，用消毒液對地面進(jìn)行清理消毒，定期檢測操作臺的潔凈度，工具、用具的擺放位置，工具的滅菌時間等。

(4)操作過程

每次使用前對操作臺進(jìn)行全面消毒，用75%的酒精把脫脂棉噴濕，然后按照從上到下，從里到外，從左到右的順序把操作臺的每個面擦拭一遍，可以重復(fù)擦但不能有遺漏的地方，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，注意操作時的先后順序，工具的使用方法，瓶口的朝向等等。

[1] 方麗,王連平,茹水江，等. 植物組培過程中污染微生物種類及其季節(jié)性的變化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，25(2)：284-287.

[2] 鄧小梅.植物組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象的研究進(jìn)展[J].江西林業(yè)科技,2004(6):33-36.

[3] 胡凱，張立軍，白雪梅，等.植物組織培養(yǎng)污染原因分析及外植體的消毒[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007，35(3): 680-681.

[4] 汪一婷.工廠化組培苗的污染及控制研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(12):2357-2358.

[5] 徐連峰.林木組織培養(yǎng)及工廠化育苗中污染的控制技術(shù)[J].防護(hù)林科技,2005,66(3):119-120.

[6] 杜雪玲,張振霞,余如剛,等.植物組織培養(yǎng)中的污染成因及其預(yù)防[J].草業(yè)科學(xué),2005(1)：24-28.

Contamination Control measures in Plant Tissue Culture

RENMu-jin,ZHOUJian-feng

(Shaanxi Seedling Reproduction Center, Mei County, Shaanxi 722305)

Contaminationsintheprocessofplanttissueculturewereclassifiedbasedonsourcesandreasons.Explantsselection,collectionandsterilizationaswellascontaminationcontrolmeasureslikesteaming,ultravioletlampandequipmentsterilizationwerehighlighted.Relevantregulationsforworkersandoperationprocedurestopreventcontaminationwereanalyzedinlightofthecontaminationtypesandreasons.

Plant;tissueculture;contamination;control

2016-07-15 作者簡介：任目瑾(1969-),女，本科，工程師，主要從事植物組織培養(yǎng)和溫室花卉栽培。

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