焦紅軍，許真真

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450001)

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·藥學(xué)研究·

響應(yīng)面分析法對蒲公英藥材中有機酸類成分提取工藝的優(yōu)化

焦紅軍，許真真

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450001)

目的探討響應(yīng)面分析法優(yōu)化蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝。方法采用高效液相色譜法，以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量為測定指標，通過響應(yīng)面分析法考察溶劑濃度、液料比、提取時間對提取工藝的影響，對結(jié)果進行二項式回歸模型擬合，優(yōu)化提取工藝。結(jié)果最佳提取工藝乙醇濃度為62.88%，料液比為16.17∶1，提取時間為 65.42 min，回流提取2次，總評歸一值預(yù)測值為0.982 0；實際測得綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分別為771.2、472.4、28.5 μg/g，總評歸一值為0.979 8，與理論預(yù)測值差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論響應(yīng)面分析法能較好地擬合蒲公英藥材中綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取工藝，所預(yù)測值與試驗值吻合較好。

響應(yīng)面分析法；蒲公英；綠原酸；咖啡酸；阿魏酸；提取工藝

蒲公英的主要有效成分為綠原酸、咖啡酸及阿魏酸等有機酸類[1～4]，但尚缺乏對其的有效開發(fā)與利用。在以往中藥材的提取工藝研究中，正交實驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝居多[5～7]，但實驗結(jié)果不精確。響應(yīng)面分析方法是采用二項式模型，擬合值更接近真實值。2015年3～6月，我們利用響應(yīng)面分析法，以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取率的總評歸一值為質(zhì)控指標，優(yōu)選蒲公英藥材有機酸類成分的提取條件。

1　儀器與試藥

蒲公英藥材經(jīng)鑒定為為菊科植物蒲公英、堿地蒲公英或同屬種植物的干燥全草。2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2998 紫外檢測器(美國Waters公司)；小型超聲波清洗機KM-615A(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司)，CPA225D十萬分之一天平(德國賽多利斯)；綠原酸、咖啡酸、阿魏酸對照品購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1綠原酸、咖啡酸及阿魏酸測定方法的建立

2.1.1蒲公英的提取取蒲公英粗粉10 g，將蒲公英提取液濃縮，用甲醇定容至25 mL；精密吸取5 mL，用甲醇溶解并定容至25 mL；用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.2色譜條件采用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B) 為流動相，梯度洗脫(0～15 min，12% A；15～40 min，12%～32% A)，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算不低于3 000 ng。

2.1.3對照品溶液的制備稱取綠原酸對照品0.723 mg、咖啡酸對照品0.421 mg,吸取34 μg/mL阿魏酸對照溶液1 mL，置10 mL容量瓶中；加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.1.4線性關(guān)系分析吸取上述混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入色譜儀；以進樣量為自變量，色譜峰面積為因變量，繪制標準曲線，建立回歸方程：y=1 725.8x+22 047，r=0.999 5，y=2 578.2x+11 342，r=0.999 4，y=1 201.4x+693.1，r=0.999 1。提示綠原酸、咖啡酸及阿魏酸分別在144.6～1 446 ng、84.2～842 ng、6.8～68 ng內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2單因素試驗

2. 2. 1乙醇濃度的影響取蒲公英粗粉10 g，選擇0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇作為提取溶劑，液料比為 20∶1，回流提取 60 min，提取2次；按2.1.2項條件測定。結(jié)果60%乙醇濃度時，有機酸類成分提取量較高，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2液料比的影響取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作為提取溶劑，提取時間為60 min，以5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的料液比，進行回流提取，提取次數(shù)2次，按2.1.2項條件測定。結(jié)果料液比15∶1對提取量的影響較小，故選擇15∶1作為料液比。

2.2.3提取時間的影響取蒲公英粗粉10 g，以 60% 乙醇作為提取溶劑，液料比為 15∶1，回流提取 60 min，提取2次，以提取時間為 20、40、60、80、100、120 min 進行回流提取，按2.1.2項條件測定。結(jié)果60 min后提取時間對提取量的影響較小，故選擇60 min作為提取時間。

2.3響應(yīng)面分析法優(yōu)選提取工藝

2.3.1回歸模型建立及方差分析通過單因素試驗，確定以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)為考察因素，響應(yīng)面試驗設(shè)計水平分為-1、0、1，設(shè)計三因素三水平17個試驗點的響應(yīng)面分析。以綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量進行綜合考量，得總評歸一值(OD)[8]。采用Design Expert軟件處理，逐步遞減回歸，以P<0.05為標準得OD值的回歸方程為OD=-10.574 539+0.336 41A+0.0872 57B+7.790 78×10-3C-1.814 91×10-5AB+1.394 23×10-5AC-1.102 23×10-4BC-2.680 21×10-3A2-2.440 50×10-3B2+5.260 72×10-5C2。對OD值模型進行方差分析，結(jié)果回歸模型極其顯著(P<0.000 1)。模型的一次項中A顯著，二次項A2和B2影響為顯著，提示所選各因素對結(jié)果的影響排序為乙醇濃度>液料比>提取時間。

2.3.2最佳提取工藝的驗證以O(shè)D值為考核指標，蒲公英藥材中有機酸類的最佳提取工藝為: 乙醇濃度為62.88%，料液比為 16.17∶1 ，提取時間為 65.42 min，此條件下的OD值預(yù)測值為0.982 0。結(jié)合實際試驗，將溶劑濃度定為 63%，料液比定為16∶1，提取時間定為 65 min，提取2次，實際測得綠原酸、咖啡酸及阿魏酸提取量分別為771.2 μg/g、472.4 μg/g、28.5 μg/g，OD值為0.979 8，這與理論預(yù)測值差異無顯著性(P>0.05)。

3　討論

蒲公英為中國傳統(tǒng)中藥材，具有較強的抗菌、抗腫瘤、利尿作用[9～11]。蒲公英的研究文獻較少，其提取工藝研究報道甚少。本文通過響應(yīng)面分析方法研究蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝，篩選最佳的提取工藝。首先，本實驗通過檢測蒲公英藥材中有機酸類成分的含量，建立了其質(zhì)量控制指標的檢測方法。綜合考察蒲公英主要有效成分綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量，來衡量蒲公英提取工藝，結(jié)果更為合理。從試驗結(jié)果顯示，乙醇濃度、料液比、提取時間為蒲公英藥材中有機酸成分提取工藝的影響因素，3個因素之間相互影響，對最終結(jié)果的貢獻不是常規(guī)意義上的線性模型[12,13]。因此，如果采用正交設(shè)計提取工藝，結(jié)果失真。響應(yīng)面分析法設(shè)計的原理是擬合二項式模型方程，以相應(yīng)面優(yōu)化提取條件，盡最大程度地擬合真實值，從而縮小了預(yù)測值與真實值的差異，結(jié)果更可信。本研究提取過程中，綠原酸、咖啡酸及阿魏酸含量往往相互影響，因此需要采綜合模式進行優(yōu)化；OD值正是將有機酸類成分的提取率綜合作為指標，與提取條件構(gòu)成響應(yīng)面，篩選最佳工藝。

因此，響應(yīng)面分析法能較好地擬合蒲公英藥材中有機酸類成分的提取工藝，二項式擬合模型更靠近真實情況。最終，通過響應(yīng)面分析法，確定最佳提取工藝，63%乙醇濃度，16∶1的料液比，提取時間65 min，回流提取2次。這為工業(yè)化生產(chǎn)合理利用蒲公英資源提供了理論依據(jù)，并且為擴大蒲公英的應(yīng)用與開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考。

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河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(14A350014)。

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R917

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1002-266X(2016)18-0092-02

2015-10-18)