陳結(jié)慧 祝勝郎 葉 玲 朱恒梅 蔣 瑩 李就鴻
(深圳市第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科,廣東 深圳 5108052)
·論著·
蛋白質(zhì)非酶糖基化終產(chǎn)物對足細(xì)胞自噬與凋亡的影響
陳結(jié)慧 祝勝郎*葉 玲 朱恒梅 蔣 瑩 李就鴻
(深圳市第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科,廣東 深圳 5108052)
目的:探討蛋白質(zhì)非酶糖基化終產(chǎn)物(AGEs)作用下人足細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)生情況及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法:體外培養(yǎng)永生化人足細(xì)胞,以AGEs 100 mg/L分別不同時間(0、4、8、12、24 h)刺激足細(xì)胞。Western blotting檢測足細(xì)胞自噬標(biāo)記性蛋白微管相關(guān)蛋白1B輕鏈3 -II/I(LC3- II/I)、自噬相關(guān)基因Atg5、哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)受體(mTOR)信號通路相關(guān)蛋白p70 S6 激酶1(p-p70 S6 Kinase,p70 S6 Kinase)表達(dá)水平;熒光顯微鏡觀察自噬溶酶體形成標(biāo)志蛋白溶酶體膜蛋白(LAMP2a);AnnexinⅤ/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞早期和晚期凋亡。結(jié)果: ①與0 h相比,100 mg/L AGEs刺激后足細(xì)胞LC3B- II/I表達(dá)水平在4、8、12、24 h均明顯下降(P<0.05);Atg5蛋白表達(dá)水平在8、12、24 h均明顯下降(P<0.05),在12 h下降達(dá)到最高峰;p-p70 S6 Kinase水平在4、8、12 h升高(P<0.05),在12 h達(dá)峰,在24 h再次下降;②免疫熒光染色結(jié)果顯示,與0 h相比,100 mg/L AGEs刺激足細(xì)胞12 h LAMP2a表達(dá)明顯減少;③與0 h相比,100 mg/L AGEs刺激后足細(xì)胞發(fā)生早期凋亡+晚期凋亡比例在4、8、12、24 h逐漸增加(P<0.05),在12 h達(dá)峰(14.07%)。結(jié)論: AGEs刺激下人足細(xì)胞自噬減少,凋亡增加,伴隨著mTOR/p70 S6 Kinase信號通路激活。AGEs可能通過mTOR/p70 S6 Kinase信號通路途徑調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬與凋亡,從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。
足細(xì)胞;自噬;凋亡;糖尿病腎病
足細(xì)胞的損傷和丟失是糖尿病腎病(DN)的主要病理改變之一。自噬和凋亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡的兩種不同方式,在體內(nèi)呈一個動態(tài)平衡的過程,共同決定細(xì)胞的命運(yùn)。已有研究表明,自噬在腎臟損傷中起保護(hù)作用[1]。在糖尿病腎病動物模型中,觀察到腎臟固有細(xì)胞自噬的減少,凋亡的增加,提示自噬異常參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制[2-3]。然而,進(jìn)一步的體外研究及相關(guān)信號通路的研究鮮有報道。蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在介導(dǎo)慢性高血糖致DN 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本研究擬通過體外培養(yǎng)人腎臟足細(xì)胞,探討AGEs刺激下人足細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)生的情況及可能的作用通路,為進(jìn)一步明確糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),γ-INF(PT公司,美國),AGEs-BSA(Biovision公司,美國),MTS(Promega公司,美國),LC3B抗體、Atg5抗體、p70 S6 kinase抗體(CST公司,美國),p-p70 S6 kinase抗體(Santa Cruz公司,美國),GAPDH(CST公司,美國),LAMP2a抗體(Abcam公司,英國),DAPI染核液(Invitrogen公司,美國),Annexin V和7-AAD(BD Biosciences公司,美國)。
1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 條件永生性人足細(xì)胞由南方科技大學(xué)生物系惠贈,參照文獻(xiàn)[4]方法培養(yǎng)。種植在含ITS(胰島素5 mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 mg/L和亞硒酸鈉5 μg/L)、10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于33 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。足細(xì)胞在33 ℃ CO2培養(yǎng)箱中處于增殖狀態(tài),培養(yǎng)液中加入50 U/mL γ-INF以促進(jìn)其增殖,每傳兩代γ-INF減為20 U/mL,最后以10 U/mL維持。待細(xì)胞生長至20%~30%融合時,轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱,無需加入γ-INF,誘導(dǎo)分化1~2周成為已分化足細(xì)胞。1.1.3 細(xì)胞分組 足細(xì)胞給予AGEs 100 mg/L干預(yù),分別刺激0,4,8,12,24 h。MTS法檢測細(xì)胞增殖活性。Western blot ting法檢測自噬標(biāo)志蛋白(LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Atg5) 和mTOR信號通路相關(guān)蛋白(p70 S6 kinase、p- p70 S6 kinase)表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞早期和晚期凋亡。選取最佳作用時間點(diǎn),免疫熒光染色檢測自噬溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP2a表達(dá)。
1.2 主要實驗方法
1.2.1 Western Blotting檢測蛋白表達(dá) 將每組足細(xì)胞徹底吸干培養(yǎng)基,每孔加入120 μL RIPA,用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量后,采用10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠檢測目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉后,將相應(yīng)的一抗 4 ℃孵育過夜,用TBST洗2次后,用相應(yīng)的稀釋好的二抗室溫下孵育1~2 h,用TBST洗3次后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。用Image J分析目標(biāo)條帶的光密度值。以GAPDH作為內(nèi)參照,比較不同處理后上述蛋白表達(dá)的差異。
1.2.2 免疫熒光檢測自噬溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP2a表達(dá) 用預(yù)冷的4%PFA(in PBS),4 ℃放置固定40 min或常溫10 min;室溫吸去PFA,用破膜劑(0.1%Triton X-100 in PBS)洗2次;室溫下用3%封閉血清封閉1 h;用PBS洗3遍;加入相應(yīng)的一抗工作液(in 3%BSA in PBS),4 ℃孵育過夜(4℃過夜后室溫復(fù)溫45 min);PBS洗3次;滴加熒光標(biāo)記的二抗,室溫避光孵育1 h。PBS洗3次;用1 000×DAPI避光染色10 min;用PBS洗3次,2 min/次;Mounting Medium封片,待Mounting Medium凝固后采用全自動正立熒光顯微鏡(Imager Z1)拍照。
1.2.3 凋亡實驗 將已分化2周且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到6孔板中,待過夜貼壁后處理如下:加入100 mg/L的AGEs-BSA刺激足細(xì)胞0 h,4 h,8 h,12 h,24 h。無EDTA胰酶消化并收集細(xì)胞,PBS清洗細(xì)胞2次。用1倍的Binding Buffer重懸細(xì)胞為1×106個細(xì)胞/mL。取100 μL上述懸液至流式管中。分別加入5 μL Annexin V和5 μL 7-AAD?;靹?,室溫避光孵育15 min。加入400 μL的Binding Buffer混勻后1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。
1.2.4 MTS實驗 取已分化2周且生長狀態(tài)良好的人腎足細(xì)胞,每孔細(xì)胞3 000個,每組3個復(fù)孔,過夜貼壁。加入100 mg/L AGEs-BSA刺激足細(xì)胞0,4,8,12,24 h后,加入MTS試劑,比例為1∶10,即100 μL培養(yǎng)液加入10 μL。37℃孵育1 h后,酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光值(A)。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
2.1 AGEs作用不同時間后足細(xì)胞增殖活性變化
與對照組0 h相比,AGEs 100 mg/L刺激足細(xì)胞4、8、12 h后,足細(xì)胞增殖活性無明顯減低,刺激24 h后足細(xì)胞增殖活性下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。
*0.80.60.40.20ODvalue0481224t/h
注:與0 h相比,*P<0.05
圖1 AGEs(100 mg/L)刺激下不同時間足細(xì)胞增殖活性(MTS)
2.2 AGEs作用不同時間后足細(xì)胞LC3B、Atg5、p70 S6 kinase和p-p70 S6 kinase蛋白表達(dá)變化
人足細(xì)胞存在基礎(chǔ)水平LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Atg5高表達(dá);與對照組0 h相比, AGEs 100 mg/L刺激后足細(xì)胞LC3B-II/I蛋白表達(dá)水平在4、8、12、24 h均明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Atg5蛋白表達(dá)水平在8、12、24 h下降(P<0.05),在12 h達(dá)峰; p-p70 S6 Kinase水平在4、8、12 h升高(P<0.05),在12 h達(dá)峰,在24 h再次下降,而p70 S6 Kinase水平無明顯變化。見圖2~5。
LC3B-ⅠLC3B-ⅡGAPDH0481224****1.20.80.40RelatlveLC3B-Ⅱ/Ⅰexpresslon0481224t/h
注:與0 h相比,*P<0.05
圖2 LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)水平
2.3 AGEs作用不同時間后足細(xì)胞凋亡情況
與0 h(早期凋亡+晚期凋亡比例為4.7%+4.17%)相比,AGEs 100 mg/L刺激足細(xì)胞4 h后細(xì)胞早期凋亡+晚期凋亡比例(6.6%+4.91%)無明顯增加;刺激8 h、12 h及24 h后細(xì)胞早期凋亡+晚期凋亡比例明顯增加,分別為5.5%+7.05%、8.22%+5.85%及6.72%+7.1%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。
***0481224t/h04812241.20.80.40Atg5GAPDHRelatlveAtg5expresslon
注:與0 h相比,*P<0.05
圖3 Atg5表達(dá)水平
Relatlvep-p7-S6Kliaseexpresslon0481224t/h4.03.02.01.00p-p7-S6KliaseGAPDH0481224
注:與0 h相比,*P<0.05
圖4 p-p70 S6 Kinase表達(dá)水平
04812240481224t/h1.20.80.40Relatlvep70S6Kliaseexpresslon70S6KliaseGAPDH
注:與0 h相比,*P<0.05
圖5 p 70 S6 Kinase 表達(dá)水平
圖6 AGEs(100 mg/L)刺激下不同時間足細(xì)胞凋亡
2.4 AGEs作用12 h后足細(xì)胞溶酶體膜蛋白LAMP2a表達(dá)情況
人足細(xì)胞存在基礎(chǔ)水平自噬溶酶體形成標(biāo)志蛋白溶酶體膜蛋白(LAMP2a)高表達(dá);與0 h組相比,AGEs 100 mg/L刺激足細(xì)胞12 h后LAMP2a表達(dá)明顯減少。見圖7。
0h12hLAMP2aDAPIMerge
圖7 AGEs (100 mg/L)刺激足細(xì)胞12 h后LAMP2a表達(dá)水平(×200)
糖尿病腎病(DN)是糖尿病的一種常見微血管并發(fā)癥,嚴(yán)重影響糖尿病患者的存活率及生存質(zhì)量。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,至今尚未完全明確。足細(xì)胞是一種高度特異性的終末分化的臟層上皮細(xì)胞,附著于腎小球基底膜外側(cè),參與構(gòu)成腎小球濾過屏障的最外層[5]。近年來的研究顯示,作為腎小球濾過屏障重要組成成分的足細(xì)胞損傷,在糖尿病腎病的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。DN中足細(xì)胞可出現(xiàn)密度和數(shù)量減少、足突增寬、足細(xì)胞脫落等改變,且可從尿中丟失,導(dǎo)致早期蛋白尿和后續(xù)的腎臟硬化,而足細(xì)胞凋亡是造成足細(xì)胞丟失的主要原因。有關(guān)足細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚未完全闡明,目前認(rèn)為與多種途徑有關(guān)。其中,蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的AGEs,在介導(dǎo)高血糖致DN 的足細(xì)胞的損傷和丟失中發(fā)揮重要作用[6]。拮抗足細(xì)胞的損傷可能是DN的治療新策略。
自噬是細(xì)胞內(nèi)一個多步驟的降解過程,由膜包囊泡包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,進(jìn)行降解,以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和代謝的穩(wěn)態(tài)[7]。同時,自噬和凋亡是導(dǎo)致細(xì)胞存活和死亡的兩種方式,細(xì)胞內(nèi)自噬與凋亡的發(fā)生是一個動態(tài)平衡的過程,共同決定細(xì)胞的命運(yùn)。其中,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)自噬和凋亡的共同樞紐。在正常生理狀態(tài)下,自噬現(xiàn)象亦廣泛存在于足細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞、隨袢升支粗段等部位,起到維持腎臟結(jié)構(gòu)、功能和代謝的穩(wěn)態(tài)的作用[8]。目前已有較多研究證實了自噬的腎臟保護(hù)作用。在缺血-再灌注損傷的細(xì)胞和動物模型中觀察到近端腎小管上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng),而抑制自噬可導(dǎo)致缺血-再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡增加[9]。在順鉑誘導(dǎo)的腎損傷模型中,觀察到近端腎小管上皮細(xì)胞LC3- II的增高及電鏡下自噬溶酶體的增加[10],提示自噬參與急性腎損傷的修復(fù)。在慢性環(huán)孢素腎病中,細(xì)胞通過激活自噬作用,來保護(hù)自身對抗死亡[11]。在自噬基因Atg5敲除小鼠中,近端腎小管缺乏自噬,出現(xiàn)嚴(yán)重蛋白尿并導(dǎo)致腎小管損傷,同時導(dǎo)致近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡[12]。在體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中,自噬呈基礎(chǔ)水平高表達(dá),抑制足細(xì)胞自噬可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,自噬可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑來調(diào)控細(xì)胞存亡[13]。本研究中,我們在體外培養(yǎng)的人足細(xì)胞中觀察到基礎(chǔ)水平的自噬標(biāo)志性蛋白LC3B-II及自噬相關(guān)基因ATg5蛋白高表達(dá),免疫熒光顯示自噬溶酶體標(biāo)志性蛋白LAMP2a存在基礎(chǔ)水平的高表達(dá),提示自噬現(xiàn)象存在于正常狀態(tài)人足細(xì)胞,與文獻(xiàn)報道相符,亦提示一定水平的自噬對維持人足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和代謝穩(wěn)態(tài)可能起著重要作用。
研究表明,DN中存在自噬穩(wěn)態(tài)水平降低[14]。Wu等[2]在鏈脲霉素糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)造模成功后1周腎組織中Beclin-1開始升高,至第8周達(dá)峰,而LC3-II水平降低。Velagapudi等[3]發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎皮質(zhì)凋亡細(xì)胞增加,同時有tuberin的磷酸化伴隨著mTOR的激活(p70 S6 Kinase磷酸化)和Bcl-2失活、Caspase-3活化和PARP的降解,在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞(PTE)tuberin 和p70 S6 Kinase磷酸化增強(qiáng),Caspase-3 活性增強(qiáng),用mTOR抑制劑雷帕霉素預(yù)處理PTE減少了凋亡細(xì)胞數(shù),提示tuberin/m TOR 通路可促進(jìn)糖尿病腎小管近端上皮細(xì)胞凋亡。Tagawa和Lenoir等發(fā)現(xiàn),自噬基因敲出的2型和1型糖尿病模型小鼠均可出現(xiàn)足細(xì)胞丟失和大量蛋白尿[15-17]。以上研究表明,自噬的異常參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。然而,目前對糖尿病足細(xì)胞自噬狀態(tài)的改變的研究尚少,其可能的作用通路亦尚未明確。
為明確DN足細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系及可能的作用通路,我們采用AGEs刺激體外培養(yǎng)的人足細(xì)胞,觀察不同時間足細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)生情況及mTOR信號通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示AGEs刺激能誘導(dǎo)人足細(xì)胞mTOR(p70 S6 Kinase磷酸化)活化,下調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3B-II及自噬相關(guān)基因Atg5蛋白表達(dá),免疫熒光亦顯示自噬溶酶體形成減少,而同時,人足細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡增加。以上結(jié)果提示,AGEs刺激下足細(xì)胞自噬減少,凋亡增加,同時伴有被認(rèn)為是自噬和凋亡的調(diào)節(jié)中樞的mTOR信號通路的激活。AGEs可能通過限制足細(xì)胞的保護(hù)性自噬,促進(jìn)足細(xì)胞凋亡而參與DN的發(fā)生發(fā)展過程。
本研究中,AGEs刺激下人足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5蛋白表達(dá)水平的下調(diào)在12 h達(dá)到高峰,同時mTOR信號通路蛋白p-p70 S6 Kinase表達(dá)水平的上調(diào)也在12 h達(dá)到高峰,而在24 h再次下降。結(jié)合MTS結(jié)果足細(xì)胞在AGEs刺激24 h增殖活性已明顯減低,考慮刺激24 h mTOR信號通路蛋白表達(dá)水平的再次下調(diào)可能與此時細(xì)胞活性已下降有關(guān)。
本研究亦存在一定的不足之處。在本研究中,我們并未使用mTOR抑制劑來觀察AGEs刺激下足細(xì)胞自噬與凋亡的變化。因此,本研究僅可得出AGEs可刺激人足細(xì)胞自噬減低,凋亡增加,伴隨著mTOR信號通路的激活的結(jié)論,提出AGEs通過mTOR信號通路抑制足細(xì)胞自噬,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡可能性。進(jìn)一步的證實有待更深入的信號通路方面研究。
綜上所述,人足細(xì)胞存在基礎(chǔ)水平自噬高表達(dá)。AGEs 刺激下足細(xì)胞自噬減少,凋亡增加,伴隨著mTOR/p70-S6 Kinase信號通路激活。AGEs可能通過mTOR/p70-S6 Kinase信號通路途徑調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬與凋亡,從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。進(jìn)一步的研究有待更深入地開展。
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(本文編輯:鄭穎)
Effects of non-enzymatic advanced glycation end products of proteins on autophagy and apoptosis of podocytes
ChenJiehui,ZhuShenglang,YeLing,ZhuHengmei,JiangYing,LiJiuhong
(DepartmentofNephrology,ShenzhenSixthMunicipalPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong5108052,China)
*Correspondingauthor:Email:nszhushenglang@163.com
Objective:To investigate the autophagy and apoptosis of podocytes under the effects of non-enzymatic advanced glycation end products (AGEs) of proteins,and the potential signal transduction pathway. Methods: Immortalized human podocytes were culturedinvitro,and stimulated with 100 mg/L AGEs at different time points (0,4,8,12 and 24 h). The expression levels of protein microtubule associated protein 1B light chain 3-II/I (LC3B-II/I),autophagy-related gene 5 (Atg5) and mammalian target of rapamycin receptors (mTOR) signaling pathway related protein p70 S6 kinase 1 (p-p70 S6 Kinase,p70 S6 Kinase) were determined by Western blotting. The lysosomal membrane protein (LAMP2a) was determined by fluorescence microscope. The early and late apoptosis of podocytes were determined by annexin V/7-AAD double staining flow cytometry. Results: ① Compared with that at 0h,the protein expression level of LC3B- II/I in podocytes at 4,8,12,and 24 h after 100 mg/L AGEs stimulation was significantly decreased (P<0.05),respectively; the protein expression level of Atg5 was significantly decreased at 8,12 and 24 h,respectively (P<0.05),and peaked at 12 h after the decrease; the levels of p-p70 S6 Kinase increased at 4,8 and 12 h (P<0.05),and peaked at 12 h,and decreased again at 24 h; ② Immunofluorescence staining showed that the podocytes LAMP2a expression was significantly decreased at 12 h after 100 mg/L AGEs stimulation,compared with that at 0 h; ③ Compared with that at 0 h,the podocytes early+late apoptosis rate increased gradually at 4,8,12 and 24 h after 100 mg/L AGEs stimulation (P<0.05),and peaked at 12 h (14.07%). Conclusion: The autophagy of human podocytes is decreased and the apoptosis is increased with AGEs stimulation,which is accompanied by the activation of mTOR/p70 S6 Kinase signal pathway. AGEs may regulate autophagy and apoptosis of podocytes through the mTOR/p70 S6 Kinase pathway,leading to the injury podocytes.
podocytes; autophagy; apoptosis; diabetic nephropathy
10.3969/j.issn.2095-9664.2016.05.02
深圳市科技局基金(201302197)
*通訊作者:Email: nszhushenglang@163.com
R329.2
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2095-9664(2016)05-0009-06
2016-01-26)