趙閆閆，喻　鳳，李　媛，竇全文

(中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧　810000)

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18個早熟禾品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建

趙閆閆，喻鳳，李媛，竇全文

(中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧810000)

摘要：利用從草地早熟禾(Poa pratensis)基因組中開發(fā)出來的3對多態(tài)性SSR引物，對18個早熟禾品種進(jìn)行分子指紋圖譜鑒別研究。結(jié)果表明：3對引物在18個品種中共檢測出16個多態(tài)性片段，每對引物可以檢測到4至6個數(shù)目不等的片段，平均為5.33個，片段大小介于152至227 bp。利用單一引物可將18個品種區(qū)分為5～11種類型，平均為8.33個類型。利用這3對SSR多態(tài)性引物指紋圖譜可以將18個品種完全區(qū)分開。研究構(gòu)建的指紋圖譜可作為對文中18個早熟禾品種進(jìn)行區(qū)分的重要參考依據(jù)，同時篩選出的對核心引物也可以用來構(gòu)建其他早熟禾品種的指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：早熟禾；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；品種鑒別

早熟禾屬(Poa)為禾本科早熟禾亞科，全世界約有500多種，我國早熟禾資源豐富，約有100多種，廣泛分布于西北、華北、東北等地區(qū)。早熟禾屬內(nèi)多數(shù)植物再生能力強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)、耐寒、耐旱，而且營養(yǎng)豐富、綠色周期長，不少種是天然和人工種植利用的優(yōu)質(zhì)牧草，也是草坪綠化常用植物[1,2]。我國的早熟禾育種起步較晚，一些早熟禾品種都是在我國本土遺傳資源基礎(chǔ)上選育出的，其具有良好的環(huán)境適應(yīng)特性，在牧草生產(chǎn)以及生態(tài)環(huán)境恢復(fù)中起著不可替代的作用，如在青藏高原地區(qū)人工種植利用青海草地早熟禾(P.pratensis)、青海扁莖早熟禾(P.pratensisvar.anceps)、以及青海冷地早熟禾(P.crymophila)等[3-6]。

在對早熟禾實際應(yīng)用中，需要針對不同生態(tài)環(huán)境和不同利用目的選擇性地利用不同的品種，但早熟禾的表型性狀區(qū)別不明顯，通過形態(tài)很難鑒別這些品種[7]。20世紀(jì)90年代DNA指紋圖譜技術(shù)就是有效的分子手段，克服了易受環(huán)境影響、周期長、工作量大等傳統(tǒng)鑒定手段的缺點，可以對品種真實性和純度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定[8]。在早熟禾早期的指紋圖譜的研究中，研究者利用RAPD、AFLP、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)對早熟禾進(jìn)行品種分類和多樣性鑒定[1,2,9-12]，但是有研究結(jié)果表明，利用某些分子標(biāo)記的品種鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果不一致[9]。Honig等[13]于2010年首次從草地早熟禾基因組DNA中分離得到了88個多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，進(jìn)一步利用其中22個標(biāo)記對247個品種和材料進(jìn)行分類研究，結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類、以及系譜分析等具有很好的一致性[14]。

筆者在試驗室開發(fā)出的15對多態(tài)性SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)上[15]，篩選可用于品種指紋圖譜構(gòu)建的多態(tài)性核心引物，并進(jìn)一步利用這些核心引物對15個國外引進(jìn)的草地早熟禾品種和3個青海本土早熟禾品種構(gòu)建指紋圖譜。

1材料和方法

1.1供試材料

3個青海本土早熟禾品種種子由青海省牧草良種繁殖場提供，其他15個進(jìn)口草地早熟禾品種購自相關(guān)牧草或草坪草種子供應(yīng)公司(表1)。

1.2草地早熟禾葉片DNA提取

將所有試驗材料發(fā)芽，單粒種植于小缽中，待試驗需要時取其葉片提取DNA。采用文獻(xiàn)[16]改良CTAB法提取基因組DNA。每個品種隨機(jī)選取10株苗的葉片混合提取DNA。

1.3SSR-PCR擴(kuò)增及檢測

SSR-PCR反應(yīng)體系：總體系25 μL，DNA 1 μL (50 ng/μL)，10×PCR Buffer 2.5 μL (含Mg2+)，dNTP 2.0 μL (2.5 mmol/μL)，TaqDNA聚合酶0.3 μL (5 U/μL)，上下游引物均為0.5 μL (10 μmol/μL)，ddH2O 18.2 μL。擴(kuò)增程序95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。所有反應(yīng)在Applied Biosystems PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳分離，經(jīng)EB稀釋液染色后，用Bio-Rad自動成像系統(tǒng)照相，后將所得的SSR譜帶和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1　18個早熟禾品種

注：1，17，18序號的品種原于青海，2～16序號的品種來源于美國

2結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性引物篩選

在草地早熟禾中開發(fā)出的15對多態(tài)性SSR標(biāo)記引物中，有13對引物在扁莖早熟禾中有擴(kuò)增產(chǎn)物，同時在這13對中有7對SSR引物在青海冷地早熟禾中有擴(kuò)增產(chǎn)物[15]。利用這15對SSR引物進(jìn)一步對18個早熟禾品種進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出多態(tài)性豐富、擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰的引物3對(表2)。

表2　多態(tài)性SSR引物

利用篩選出的3對引物在18個品種中共檢測出16個多態(tài)性片段，每對引物可以檢測到4～6個數(shù)目不等的片段，平均為5.33個，片段大小為152～227 bp (表3)。

表3　18個早熟禾品種中檢測到的SSR標(biāo)記片段

2.2指紋圖譜構(gòu)建

利用篩選到的核心引物對18個早熟禾品種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，其中利用引物Poap10的指紋圖譜如圖1所示。進(jìn)一步將3對引物對8個品種指紋圖譜加以數(shù)字化制成表格，如表4所示。單獨利用SSR引物Poap5根據(jù)帶型組合可以將18個品種分類成5種類型，利用引物Poap9可以將18個品種分成9種類型，利用引物Poap10也可以將18個品種分成不同的11種類型。利用引物組合Poap5和Poap9、以及利用Poap5和Poap10可以將18個品種中12個品種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，利用引物組合Poap9和Poap10可以將18個品種中14個品種進(jìn)行區(qū)分，聯(lián)合應(yīng)用這3對應(yīng)物可以將18個品種中每一個品種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

圖1　SSR引物Poap10 在18個早熟禾品種中的電泳圖Fig.1　Electrophoresis of 18 cultivars by using SSR marker Poap10注：M為DNA分子量marker；1～18為不同早熟禾品種，序號與表1一致

表4　3對引物在18個早熟禾品種的SSR指紋圖譜

3討論與結(jié)論

草地早熟禾為早熟禾類植物中利用最為廣泛的物種，由于其兼性無融合生殖特性，草地早熟禾在染色體數(shù)目上呈現(xiàn)較高的變異性，在群體中有不同倍性以及非整倍體個體的存在[17,18,19]，這種復(fù)合多倍體使得草地早熟禾種內(nèi)具有很高的遺傳多樣性[20]。從草地早熟禾基因組中開發(fā)的基因組SSR標(biāo)記在草地早熟禾不同材料間呈現(xiàn)很高的多態(tài)性，檢測到的SSR標(biāo)記等位基因平均數(shù)量隨著檢測材料數(shù)量和標(biāo)記數(shù)量的增多呈顯著上升趨勢，試驗中利用3個SSR標(biāo)記對18個品種進(jìn)行檢測，檢測到多態(tài)性平均為5.33個，Honig等利用25個SSR標(biāo)記對247個品種(材料)進(jìn)行多態(tài)性分析，檢測到的多態(tài)性位點平均為16.04個[11]，利用88個SSR標(biāo)記對265個品種(材料)進(jìn)行多態(tài)性分析，88個SSR標(biāo)記能夠檢測到的等位基因位點平均為38.83個[12]。同時，由于草地早熟禾群體遺傳結(jié)構(gòu)組成的特殊性，利用同一引物在不同個體或同一個體中有可能檢測到1個以上的等位基因位點，草地早熟禾的這種變異特性，極大地提高了SSR標(biāo)記對不同品種和材料的分辨能力。

試驗研究中18個早熟禾品種中，16個品種為草地早熟禾品種，其他2個品種分別為扁莖早熟禾和冷地早熟禾品種，而利用的3個SSR標(biāo)記是從草地早熟禾中開發(fā)出來的，其中，2個標(biāo)記在扁莖早熟禾和冷地早熟禾中有擴(kuò)增產(chǎn)物，1個標(biāo)記沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，標(biāo)記Poap5可以顯著地將扁莖早熟禾、冷地早熟禾品種與其他草地早熟禾品種區(qū)分出來，進(jìn)一步可以利用Poap9可將扁莖早熟禾品種和冷地早熟禾品種進(jìn)行區(qū)分。由于迄今只有少量其他早熟禾物種中具有可供利用的SSR標(biāo)記[21]，因此，在其他早熟禾物種品種鑒別中借鑒利用從草地早熟禾中開發(fā)出來的SSR標(biāo)記，不失為一種簡便、快速的手段。

SSR分子標(biāo)記指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)在小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物品種中得到廣泛應(yīng)用，由于SSR分子標(biāo)記技術(shù)在早熟禾研究中起步較晚，利用SSR分子標(biāo)記對早熟禾品種進(jìn)行指紋圖譜鑒定鮮見報道，在本研究中嘗試?yán)肧SR分子標(biāo)記對18個早熟禾品種進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明由于早熟禾的高變異特性，利用少量的SSR標(biāo)記就可以實現(xiàn)對不同品種的準(zhǔn)確區(qū)分。同時，SSR標(biāo)記具有檢測操作過程簡便、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，相信SSR指紋圖譜構(gòu)建技術(shù)在早熟禾品種鑒別中將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。

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Fingerprint establishment of 18Poapratensiscultivars with SSR markers

ZHAO Yan-yan，YU Feng，LI Yuan，DOU Quan-wen

(NorthwestInstituteofPlateauBiology，ChineseAcademyofSciences，Xining810000，China)

Abstract：The fingerprint of 18 Poa pratensis cultivars was established by using 3 polymorphic simple sequences repeat (SSR) markers developed from genomic DNA of P. pratensis. Totally 16 polymorphic SSR fragments were detected in all tested cultivars，and 4 to 6 alleles were detected by each pair of SSR primer with an average of 5.33. The band size varied from 152 bp to 227 bp. 18 cultivars could be divided into 5 to 11 groups by single polymorphism primer，with an average of 8.33. 18 cultivars could be distinguished thoroughly by the fingerprinting maps constructed by the 3 pairs of SSR primers. The constructed fingerprinting maps are important references to discriminate the 18 tested cultivars. Furthermore，the screened 3 polymorphic SSR markers can be useful to establish fingerprint for other cultivars.

Key words：P. pratensis；SSR marker；fingerprinting；cultivar identification

中圖分類號：Q 789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)01-0031-05

作者簡介：趙閆閆(1990-)，女,安徽蚌埠人，在讀碩士生。

基金項目：青海省科技廳科技促進(jìn)新農(nóng)村建設(shè)計劃項目(2013-N-515)資助

收稿日期：2015-05-28； 修回日期：2015-12-03

E-mail：yanyanziji@126.com

竇全文為通訊作者。