周瓊瓊　佘萬東

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·實(shí)驗(yàn)研究·

HDAC2對豚鼠急性聽力損失治療中糖皮質(zhì)激素抵抗的影響*

周瓊瓊1佘萬東1

【摘要】目的觀察地塞米松(dexamethasone，DEX)加氨茶堿(amionophylline,AMI)治療脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的豚鼠急性聽力損失的療效及耳蝸組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2，HDAC2)的表達(dá)，探討治療中HDAC2對糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)抵抗的影響。方法選取50只健康白色豚鼠，其中10只為對照組，僅雙耳鼓階注入5 μl 人工外淋巴液(artificial perilymph，AP)(AP組)；其余40只鼓階注入5 μl(5 mg/ml)的LPS后再隨機(jī)分為4組，每組10只：模型組(LPS組)，無其他處理；LPS+DEX組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射DEX 1 mg/kg；LPS+AMI組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射AMI 20 mg/kg;LPS+DEX+AMI組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射AMI 20 mg/kg及DEX 1 mg/kg。所有動物給藥前及鼓階注射術(shù)后48小時行ABR檢測后取耳蝸，采用免疫熒光法，觀察耳蝸基底膜鋪片及耳蝸組織冰凍切片中HDAC2的分布及空間定位，用ELISA法測定耳蝸組織中HDAC2的含量。 結(jié)果LPS組鼓階注射LPS后48小時全頻聽力損失，由低頻向高頻逐漸加重；LPS+DEX組及LPS+AMI組16、32 kHz ABR閾移較LPS組改善明顯(<0.05)，LPS+DEX+AMI組各頻率ABR閾移均低于LPS+DEX組(P<0.05)，以16 kHz處最顯著(P<0.01)。耳蝸基底膜鋪片及耳蝸冰凍切片免疫染色結(jié)果表明HDAC2廣泛分布于耳蝸中，且主要存在于胞核內(nèi)。8、16、32 kHz ABR閾移與耳蝸內(nèi)HDAC2的含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論AMI可提高豚鼠耳蝸HDAC2的表達(dá)，HDAC2可改善治療中GC抵抗，對提高GC治療LPS導(dǎo)致的急性聽力損失的敏感性有一定的作用。

【關(guān)鍵詞】組蛋白去乙?；?；糖皮質(zhì)激素抵抗;聽力損失；氨茶堿;豚鼠

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)已被廣泛用于治療突發(fā)性聾、自身免疫性內(nèi)耳疾病、梅尼埃病等內(nèi)耳疾病及細(xì)菌性中耳炎造成的感音神經(jīng)性聾[1]。臨床研究提示部分患者使用GC治療后效果不明顯，存在對GC不敏感或抵抗[2，3]。目前認(rèn)為GC抵抗的可能原因與遺傳因素、核轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、競爭性糖皮質(zhì)激素受體β(glucocorticoid receptor-β，GRβ)表達(dá)增加及促炎相關(guān)因子，如：活化蛋白1(activator protein 1，AP1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor κB，NF-κB)過多激活等有關(guān)[4～6]。最近研究表明組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)的表達(dá)及活性下降是GC抵抗的重要機(jī)理[7，8]。

HDAC2通過調(diào)控組蛋白的乙?；?，影響染色體重塑，抑制抗炎基因轉(zhuǎn)錄，在GC介導(dǎo)的抗炎過程中通過募集HDAC2抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。Ito等[9]研究發(fā)現(xiàn)炎癥可降低HDAC2的活性，從而降低靶細(xì)胞對GC的敏感性；炎癥反應(yīng)參與了各種因素導(dǎo)致的突發(fā)性聾發(fā)生發(fā)展過程[10]；前期研究發(fā)現(xiàn)難治性突發(fā)性聾患者外周血單個核細(xì)胞HDAC2活性下降，鼓室灌注GC有效者，HDAC2活性增加[11]。最近研究表明低劑量氨茶堿 (aminophylline，AMI)有重要的抗炎作用，主要是通過提高HDAC2的活性，改善GC抵抗?fàn)顟B(tài)[12]。因此，本研究擬通過向豚鼠鼓階內(nèi)直接注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，使其內(nèi)耳產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致急性聽力損失，同時給予地塞米松(dexamethasone, DEX)治療,并全身應(yīng)用AMI，觀察其療效及耳蝸HDAC2的表達(dá)，探討HDAC2對GC治療急性聽力損失的敏感性的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物分組及處理實(shí)驗(yàn)動物為健康成年白色紅目豚鼠50只，體重250～350 g，雌雄不限(南京鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場)。隨機(jī)選擇10只，雙耳均經(jīng)鼓階給予5 μl人工外淋巴液(artificial perilymph, AP)作為對照組(AP組)；其余40只豚鼠行鼓階微量注射術(shù)，注入5 μl(5 mg/ml)的LPS(Sigma，America)，再隨機(jī)分為4組，每組10只：模型組(LPS組)，無其他處理；LPS+DEX組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射DEX 1 mg/kg；LPS+AMI組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射AMI 20 mg/kg;LPS+DEX+AMI組：術(shù)前30 min及術(shù)后24小時腹腔注射AMI 20 mg/kg及DEX 1 mg/kg。所有豚鼠實(shí)驗(yàn)前及術(shù)后48小時均行ABR檢測，排除實(shí)驗(yàn)前聽力下降者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1急性內(nèi)耳損傷造模方法[13]豚鼠麻醉后，切開耳后皮膚，打開聽泡，在耳蝸底回靠近圓窗邊緣打孔，用微量推進(jìn)器緩慢注入5 μl AP[14]或等體積、濃度為5 mg/ml的LPS，用肌肉組織填塞，縫合皮膚，待其蘇醒后，放回籠內(nèi)自由喂養(yǎng)。

1.2.2聽性腦干反應(yīng)檢測使用TDT-system3(RZ6，Tucker-Davis Technology)系統(tǒng)檢測。聲信號為10 ms短純音，上升/下降時間為5 ms， 疊加1 024次，重復(fù)率21.1次/秒。刺激經(jīng)MF1揚(yáng)聲器閉合聲場給予。動物麻醉后置于屏蔽室恒溫電熱毯上，記錄電極刺入顱頂皮下，參考及接地電極分別刺入左、右側(cè)乳突皮下。測試頻率為4、8、16、32 kHz，刺激聲強(qiáng)度從90 dB SPL開始，5 dB下降一檔，以剛剛誘發(fā)出可辨認(rèn)波Ⅲ的最小聲強(qiáng)值為ABR反應(yīng)閾，將同一只動物雙耳平均閾移作為該動物的ABR閾移。ABR檢測完后即行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3耳蝸鋪片及免疫染色每組隨機(jī)取2只動物，迅速取出聽泡，暴露耳蝸，于蝸尖打孔，刺破圓窗，灌注4%多聚甲醛固定過夜后，分離基底膜。5%羊血清封閉30分鐘，加入一抗anti-HDAC2(Abcam， Cambridge， UK) 1:1 000，4 ℃過夜，用PBS漂洗，加入標(biāo)記Alexa Fluor-555山羊抗兔IgG(Abcam， Cambridge， UK)1:1 000及FITC-鬼筆環(huán)肽(phalloidin)(cytoskeleton， USA)1：500及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，避光孵育1小時，PBS漂洗。最后將標(biāo)本平鋪于載玻片上，封片，用熒光顯鏡觀察HDAC2的分布，分析熒光強(qiáng)度，觀察毛細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.4耳蝸冰凍切片及免疫染色每組隨機(jī)取3只動物，迅速取出雙側(cè)聽泡，暴露耳蝸，蝸尖打孔，注入4%多聚甲醛固定過夜。PBS漂洗，10%的乙二胺四乙酸二鈉 ( EDTA)中脫鈣3～4周。30%蔗糖脫水后，用OCT膠包埋，平行于蝸軸行8 μm冰凍切片。免疫熒光染色方法同基底膜染色。用熒光顯微鏡觀察HDAC2在耳蝸切片中的空間分布及各組熒光強(qiáng)度的變化。

1.2.5HDAC2蛋白含量檢測每組隨機(jī)取3只動物，迅速取出雙側(cè)聽泡。解剖顯微鏡下取出耳蝸軟組織放入1.5 ml EP管中，手動研磨充分后，用細(xì)胞核與細(xì)胞漿提取試劑盒(碧云天，北京)提取細(xì)胞核蛋白，按BCA法(碧云天，北京)對上述提取的核蛋白進(jìn)行定量后，按照EPIQUIK HDAC2 Assay kit(Epigentek，Brooklyn，NY)說明操作，用ELISA法檢測，檢測波長450 nm，用吸光度(A)代表HDAC2蛋白含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，采用one way ANOVA Least-Significant Difference(LSD)檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組ABR閾移由表1可見，AP組4、8、16 kHz平均閾移均小于10 dB，32 kHz閾移為11.50 ±11.56 dB；LPS組術(shù)后48 h全頻聽力損失，由低頻到高頻逐漸加重，32 kHz聽力損失最嚴(yán)重，說明急性內(nèi)耳損傷致聽力損失模型造模成功。LPS+DEX組及LPS+AMI組16、32 kHz ABR閾移較LPS組改善明顯(P<0.05)，但LPS+DEX組和LPS+AMI組之間各頻率ABR閾移差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。LPS+DEX+AMI組各頻率ABR閾移均低于LPS+DEX組(P<0.05)，16 kHz處最顯著(P<0.01)。

組別耳數(shù)(耳)頻率(kHz)481632AP組203.35±9.193.75±7.667.00±8.0611.50±11.56LPS組2019.50±14.33*34.25±15.28*58.75±20.66*60.75±6.02*LPS+DEX組2016.50±15.4230.25±27.9742.50±22.64#46.00±16.80#LPS+AMI組2014.25±9.3619.00±14.1531.75±14.53#34.00±13.60#LPS+DEX+AMI組204.25±7.27△10.25±14.55△18.25±14.29△△31.00±16.08△

注：*與AP組相比，P<0.01；#與LPS組相比，P<0.05；與LPS+DEX組相比，△P<0.05，△△P<0.01

2.2HDAC2在各組耳蝸的表達(dá)及定位耳蝸基底膜鋪片顯示，各組毛細(xì)胞無明顯缺失，三排外毛細(xì)胞纖毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無缺失(圖1)。HDAC2在耳蝸基底膜廣泛表達(dá)，包括內(nèi)外毛細(xì)胞、內(nèi)外支持細(xì)胞等，與DAPI分布范圍一致，提示HDAC2在耳蝸組織中主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。耳蝸冰凍切片顯示，HDAC2在蝸軸、螺旋韌帶、血管紋區(qū)域均有廣泛表達(dá)(圖2)。

2.3各組耳蝸HDAC2蛋白表達(dá)LPS組HDAC2的表達(dá)量(0.354±0.039)顯著低于AP組(0.442±0.047)(t=2.49，P<0.05)，LPS+DEX組HDAC2蛋白表達(dá)量(0.376±0.051)較LPS組(0.354±0.039)未明顯增加(t=0.61，P>0.05)，與LPS組相比，LPS+DEX+AMI組耳蝸中HDAC2表達(dá)量(0.439±0.054)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.53，P<0.05)。

2.4ABR閾移與耳蝸組織中HDAC2表達(dá)的相關(guān)性將各組耳蝸HDAC2的蛋白表達(dá)量(用吸光度A表示)與各頻率ABR閾移進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在4 kHz處兩者間無相關(guān)性(r=-0.38，P>0.05)，而在8、16、32 kHz處兩者呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.56、-0.68、-0.62；P<0.05)。

3討論

很多內(nèi)耳疾病中存在炎癥反應(yīng)過程，如突發(fā)性聾、自身免疫性內(nèi)耳病、年齡相關(guān)性聾等。Ulu等[15]研究發(fā)現(xiàn)突發(fā)性聾患者血清中中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率較健康對照組顯著增高。LPS為細(xì)菌內(nèi)毒素，眾多動物實(shí)驗(yàn)研究[16，17]發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳局部應(yīng)用LPS可引起耳蝸炎性細(xì)胞浸潤，損傷血管紋，造成內(nèi)外毛細(xì)胞腫脹、變性甚至凋亡，導(dǎo)致急性聽力損失。本研究將LPS注射到豚鼠耳蝸底回中，造成動物急性聽力損失，高頻區(qū)聽力損失最嚴(yán)重，與文獻(xiàn)報道一致[17]，可能為藥物直接作用于耳蝸底回，使該區(qū)域藥物濃度短時間內(nèi)達(dá)最大，因此高頻區(qū)聽力損傷最嚴(yán)重。本研究中對照組(AP組)，除32 kHz外其余各頻率術(shù)后閾移均在10 dB以內(nèi)，因此，可忽略鼓階注射術(shù)造成的損傷。Marwick等[18]研究表明炎癥及氧化應(yīng)激可激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，磷酸化HDAC2絲氨酸殘基，可導(dǎo)致HDAC2活性下降，并增加其降解；Ni等[19]向羊膜腔內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)支氣管肺發(fā)育不良動物模型，發(fā)現(xiàn)LPS可以降低HDAC2的表達(dá)及活性。本研究結(jié)果顯示在豚鼠內(nèi)耳組織中注射LPS可產(chǎn)生急性炎癥，可觀察到耳蝸內(nèi)HDAC2表達(dá)下降；基底膜鋪片及冰凍切片結(jié)果均表明HDAC2在內(nèi)耳組織中廣泛表達(dá)，且存在于細(xì)胞核內(nèi)，熒光染色顯示各組耳蝸中均無明顯的毛細(xì)胞缺失，可能的原因?yàn)長PS造模后兩天，時間較短，毛細(xì)胞形態(tài)保留(鬼筆環(huán)肽標(biāo)記)，但功能已部分喪失。

圖1　耳蝸基底膜鋪片

圖2　耳蝸冰凍切片

近年來HDAC2與GC抵抗的分子機(jī)制相關(guān)性研究成為熱點(diǎn)。GC通過募集HDAC2至促炎啟動子區(qū)，使靶基因組蛋白去乙?；?，DNA由疏松態(tài)轉(zhuǎn)為緊密態(tài)，抑制NF-κB激活的促炎基因的轉(zhuǎn)錄[9]。Barnes等[6]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；叭ヒ阴；苎装Y影響。炎癥及氧化應(yīng)激可激活并穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子1α亞基(HIF-1α)，激活的HIF-1α可降低核因子-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)的表達(dá)[20]，從而通過Nrf2-HDAC2軸來影響HDAC2活性及表達(dá)[21]，使得GC治療不敏感及抵抗。本實(shí)驗(yàn)中LPS+DEX組豚鼠鼓階注射LPS前后全身應(yīng)用DEX，結(jié)果與LPS組相比，其聽功能改善并不顯著，提示存在GC不敏感及抵抗；ABR閾移與耳蝸組織中HDAC2表達(dá)的相關(guān)性分析表明耳蝸組織中HDAC2含量越高，DEX的療效越好，提示HDAC2對提高GC敏感性有一定作用。

近年來有研究表明，茶堿在低劑量時，能發(fā)揮抗炎效應(yīng)，同時提高哮喘患者對GC的療效，這種抗炎作用主要是通過抑制PI3Kδ，提高HDAC2的活性，改善GC抵抗?fàn)顟B(tài)[22]。AMI為茶堿與乙二胺復(fù)鹽，水溶性更強(qiáng)；本實(shí)驗(yàn)中LPS+DEX+AMI組動物鼓階注射LPS前后給予AMI聯(lián)合DEX治療后，豚鼠耳蝸內(nèi)HDAC2表達(dá)較LPS組增強(qiáng)，提示AMI可提高HDAC2的含量，改善GC抵抗?fàn)顟B(tài)。另外LPS+AMI組動物的急性聽力損失亦有一定的改善，可能是因?yàn)锳MI恢復(fù)HDAC2的活性，抑制了炎癥相關(guān)基因的激活，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究表明AMI可提高豚鼠耳蝸HDAC2的表達(dá)，從而提高GC對LPS誘導(dǎo)的急性聽力損失的療效。通過提高HDAC2的活性或/和含量，改善治療中GC抵抗，為GC治療眾多內(nèi)耳疾病提供了新思路。由于GC不敏感的相關(guān)機(jī)制很多，而且動物模型還需要臨床研究的支持，希望在將來的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步研究內(nèi)耳中GC不敏感的相關(guān)分子機(jī)制以及HDAC2下降的機(jī)制，以指導(dǎo)GC抵抗患者的臨床治療。

(致謝 ：本實(shí)驗(yàn)得到了東南大學(xué)王堅、劉莉潔、柴人杰教授，美國Hough Ear Institute杜小平研究員的指導(dǎo)，在此表示衷心感謝！)

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(2015-09-16收稿)

(本文編輯李翠娥)

HDAC2 is Associated with Glucocorticoid Sensitivity in LPS-induced Sudden Hearing Loss in Guinea Pig

Zhou Qiongqing, She Wandong

(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, the Affiliated Drum Tower Hospital Medical School of Nanjing University, Nanjing, 210008, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of histone deacetylase 2(HDAC2) expression by aminophylline on glucocorticoid sensitivity of guinea pigs with lipopolysaccharide-induced sudden hearing loss.MethodsFifty guinea pigs were randomly divided into five groups : control/ artificial perilymph(AP) group (n=10) in which both the ears were administrated 5 μl sterile artificial perilymph fluid by means of drilling the scala tympani of the cochlear basal turn; whereas 5 μl of 5 mg/ml LPS was transferred into the cochlea of both the ears of other groups in the same way,which were model(LPS) group(n=10), lipopolysaccharide+ dexamethasone(LPS+DEX) group(n=10), lipopolysaccharide+ aminophylline(LPS+AMI) group(n=10), and lipopolysaccharide+ dexamethasone+ aminophylline(LPS+DEX+AMI) group(n=10). Guinea pigs with normal hearing tested by auditory brain stem response (ABR) before treatment were included in this study. ABRs were recorded in all guinea pigs 48 hours after surgery. The immunofluorescence staining was used to detect for the HDAC2 in the inner ear. The HDAC2 levels in the cochlea of guinea pigs were detected by ELISA test. ResultsABR results showsed that hearing loss in AP group was mild, the threshold shifts were less than 10 dB at 4 kHz,8 kHz,16 kHz frequencies, at 32 kHz the threshold shift was 11.50 dB, respectively. However, the hearing loss was obvious in LPS group, especially at the high frequency (the threshold shift was 60.75±6.02 dB SPL). Compared to AP group, hearing loss in LPS group was statistically significant at all frequencies (P<0.01). The hearing improvement was obvious at frequeniies of 16 kHz and 32 kHz in group of LPS+DEX and LPS+AMI (P<0.05). The LPS+DEX+AMI treatment for LPS-induced acute hearing loss was the most remarkable at all frequencies compared with glucocorticoid or aminophylline treatment alone, especially at 16 kHz (P<0.05). The immunofluorescence staining showed positive expression of HDAC2 in the cochlea in the inner and outer hair cells, stria vascularis, spiral ganglion and spiral ligament. The correlation analysis showed negative correlations between the expression of HDAC2 and threshold shift of ABR at 8 kHz, 16 kHz, and 32 kHz (P<0.05).ConclusionIt is effective for dexamethasone and aminophylline treatment in induced hearing loss in guinea pigs. Aminophylline can elevate HDAC2 expression and improve the effect of glucocorticoid. In conclusion, HDAC2 plays a critical role in restoring glucocorticoid sensitivity in the inner ear.

【Key words】HDAC2;Glucocorticoid insensitivity;Hearing loss;Aminophylline;Guinea pig

【中圖分類號】R764.43+7

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)02-0157-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.012

作者簡介：周瓊瓊，女，安徽人，研究生，主要研究方向?yàn)槁犃W(xué)基礎(chǔ)與臨床。通訊作者：佘萬東(Email:shewandong@163.com)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.r.20151230.1119.008.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2015-12-3011:19

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81271074)、江蘇省第十批“六大人才”高峰項(xiàng)目(WSN-009)、江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)(BL2014002)、南京市國際聯(lián)合研究項(xiàng)目(2012sd311038)聯(lián)合資助

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉科(南京210008)