吳瑋　陳娜　韓浩倫　王剛　王鴻南　周麗斌　李保衛(wèi)　丁瑞英

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·實驗研究·

模擬失重和噪聲對大鼠聽功能及耳蝸Corti器損傷的協(xié)同作用*

吳瑋1陳娜1韓浩倫1王剛1王鴻南1周麗斌1李保衛(wèi)1丁瑞英1

【摘要】目的探討模擬失重和噪聲對大鼠聽功能及耳蝸Corti器損傷的協(xié)同作用。 方法48只大鼠隨機分為空白組、失重組、噪聲組和失重+噪聲組，每組12只。失重組以Morey-Holton法模擬失重環(huán)境，噪聲組暴露的噪聲環(huán)境為模擬航天載人飛船內(nèi)復合噪聲，包括72±2 dB SPL的持續(xù)穩(wěn)態(tài)噪聲和160 dB SPL的脈沖噪聲，失重+噪聲組則同時暴露于上述失重及噪聲環(huán)境中，空白組常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。分別于暴露1周和2周后，每組隨機選出6只大鼠行ABR閾值檢測后取材行HE染色、免疫熒光(DAPI)染色及掃描電鏡觀察耳蝸的形態(tài)學變化。結(jié)果暴露2周后大鼠ABR閾值較暴露1周時升高，失重+噪聲組ABR閾值最高(P<0.01)，其次為噪聲組。HE染色示暴露1周和2周后除空白組外各組大鼠耳蝸Corti器均有不同程度的損傷，失重+噪聲組最嚴重。免疫熒光染色示暴露1周后大鼠耳蝸毛細胞死亡方式以腫脹壞死為主，失重+噪聲組最嚴重(腫脹率10%)，其次為噪聲組(腫脹率3.33%)；暴露2周后大鼠耳蝸外毛細胞以核缺失為主，失重+噪聲組缺失率最高(缺失率13.6%)，其次為噪聲組(缺失率12.7%)，失重組毛細胞缺失以內(nèi)毛細胞為主。 掃描電鏡示，失重+噪聲組毛細胞靜纖毛損傷最嚴重，其次為噪聲組，再次為失重組。結(jié)論模擬失重和噪聲環(huán)境對大鼠聽功能的影響有協(xié)同作用，且這種協(xié)同作用對耳蝸Corti器有顯著的損傷作用。

【關(guān)鍵詞】模擬失重；噪聲；Corti器；聽性腦干反應

研究發(fā)現(xiàn)，飛行器內(nèi)噪聲是一個比較突出的危險因素，可以造成飛行人員永久性的聽力損傷[1，2]。在載人航天飛船中，不僅存在噪聲，失重也是很重要的一種持續(xù)存在的特殊狀態(tài)。失重也可以引起動物聽覺系統(tǒng)的損害，并且其與噪聲同時存在時，對聽覺的影響更為明顯[3，4]，但損傷是由于兩者的協(xié)同還是簡單的疊加作用尚不明確。為此本實驗擬通過ABR閾值檢測、耳蝸形態(tài)學和毛細胞的免疫熒光、掃描電鏡觀察等，研究模擬失重和噪聲對大鼠聽功能的影響及其對耳蝸Corti器的損傷，報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取健康雄性SD大鼠48只，體重190±10 g，由北京市興隆實驗動物養(yǎng)殖場提供，耳廓反射靈敏，鼓膜標志清晰，無強噪聲暴露及耳毒性藥物應用史。實驗前所有大鼠進行聽性腦干反應 (ABR) 閾值測試無明顯差異。隨機分為空白組、失重組、噪聲組和失重+噪聲組，每組12只(24耳)。失重組以持續(xù)頭低位尾吊Morey-Holton法[5]模擬失重環(huán)境，噪聲組暴露于模擬航天載人飛船內(nèi)復合噪聲環(huán)境，包括72±2 dB SPL的穩(wěn)定噪聲和160 dB SPL的脈沖噪聲，失重+噪聲組同時暴露于以上兩種環(huán)境，空白組不做任何處理。分別在暴露1周和2周后，每組隨機選取6只大鼠行ABR閾值，然后取耳蝸HE染色、免疫熒光染色、電鏡檢測觀察耳蝸的形態(tài)學變化。

1.2模擬失重方法 采用目前國際通用的頭低位模擬失重法(Morey-Holton法)[5]，尾部用膠帶纏于懸吊的鐵絲上，保持大鼠頭低位，后肢完全離地，前肢承擔部分身體重量，身體縱軸與水平面呈30o夾角，懸吊1周或者2周。懸吊期間保證動物可以自由活動與進食。

1.3噪聲暴露方法 采用穩(wěn)態(tài)噪聲與脈沖噪聲的復合環(huán)境，穩(wěn)態(tài)噪聲由白噪聲信號發(fā)生器(UZ-3型)，經(jīng)均衡器(MEQ)，功率放大器(PA-1000)傳到揚聲器(YZ20-7)，將揚聲器放置于大鼠籠前部。穩(wěn)態(tài)噪聲聲強用BK2250手持式分析儀測量，測得其聲壓級為72±2 dB SPL，每天持續(xù)暴露8小時，暴露1周或2周后給予脈沖噪聲；脈沖噪聲由氣動激波管產(chǎn)生傳到傳聲器(BK4136)，峰值聲壓級為160 dB SPL，有效持續(xù)時間為30 ms，3次，每次間隔為1 min。脈沖噪聲聲級由BK2209精密脈沖聲級計測量，用TDS2022數(shù)字示波器記錄波形。

1.4ABR閾值測試 所有大鼠在實驗前進行ABR閾值檢測，各組大鼠持續(xù)暴露于相應環(huán)境1到2周后進行ABR閾值測試，空白組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周或2周后行ABR測試。大鼠給予咪唑安定(80 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪注射液(200 mg/kg)進行肌肉注射麻醉，應用聽性腦干反應儀在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)檢測雙耳短聲誘發(fā)的ABR反應閾值，顱頂為記錄電極，測試耳為參考電極，鼻尖處為地線。刺激強度為5～97 dB SPL，間隔5 dB(濾波帶寬80～3 000 Hz，疊加次數(shù)1 024 次，掃描10 ms)，以重復性好、比較穩(wěn)定的波Ⅲ判斷反應閾值。測試及麻醉復蘇過程中保持環(huán)境溫度在38℃左右并用熱水瓶保持大鼠體溫恒定。

1.5動物取材大鼠ABR閾值檢測完后隨即斷頭取其耳蝸，每組每個時間點分別隨機選取2只(4耳)行HE染色，2只(4耳)行DAPI染色，2只(4耳)行電鏡觀察。

1.6HE染色 將耳蝸置于4%多聚甲醛液中，在解剖顯微鏡下摘除鐙骨，灌流4%多聚甲醛固定，4℃冰箱過夜后用10%EDTA脫鈣2周，物理法測定脫鈣終點。耳蝸石蠟包埋，包埋時蝸軸與切面平行，連續(xù)切片，片厚3～5 μm，行HE染色。

1.7基底膜鋪片及DAPI染色 取出4%多聚甲醛液中固定的耳蝸，于PBS溶液中在解剖顯微鏡下用游絲鑷剝除蓋膜、螺旋韌帶等部位，取出基底膜。將分離好的基底膜置于EP管中，PBS 漂洗、5%BSA 溶液常溫下封閉30分鐘， PBS 溶液漂洗后放入 4℃冰箱過夜。第二天取出標本，所有操作均在避光條件下進行，PBS 溶液漂洗后加入DAPI溶液反應10分鐘，以PBS溶液漂洗3 次，每次5分鐘；將基底膜取出，平鋪于潔凈的載玻片上，滴加兩滴甘油，蓋上蓋玻片，將玻片置于共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 880)下，在60倍下觀察，DAPI激發(fā)波長為405 nm，410～490 nm接收。實驗中對所觀察區(qū)域的毛細胞進行序列掃描，掃描層距設(shè)定為2.0 μm。

1.8掃描電鏡檢查 大鼠處死即刻取耳蝸，用2.5%戊二醛固定液進行離體耳蝸灌注。固定4 h后，采用硬剝法暴露出基底膜。處理后的內(nèi)耳標本進行脫水、干燥、鍍金等處理。置于掃描電鏡(Hitachi S4800)下觀察，拍照。

1.9統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理，各組ABR閾值比較采用單因素方差分析和Post-Hoe方法聯(lián)合應用，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1ABR閾值各組實驗前ABR反應閾值無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。暴露1周大鼠的ABR反應閾值較同等環(huán)境下暴露2周的大鼠低。暴露1周和2周后，空白組與噪聲組、失重+噪聲組，失重組與噪聲組、失重+噪聲組，噪聲組與失重+噪聲組之間均有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)，噪聲組、失重+噪聲組比空白組和失重組ABR閾值高(P<0.01)，失重+噪聲組比噪聲組ABR閾值高(P<0.01)(表1)。

(n=12耳)

注：*與空白組和失重組比較，P<0.01；△與噪聲組比較，P<0.01

2.2耳蝸HE染色觀察結(jié)果空白組大鼠耳蝸Corti器清晰，外毛細胞排列整齊且無明顯缺失(圖1a、1e)；暴露后各組大鼠均有不同程度的毛細胞缺失：失重組內(nèi)毛細胞缺失，螺旋器形狀改變(圖1b、1f)；噪聲組螺旋器萎縮，外毛細胞位置錯亂，排列不齊，前庭膜向前庭階略突出(圖1c、1g)；失重+噪聲組螺旋器萎縮，外毛細胞排列不齊(圖1d)，暴露2周組大鼠耳蝸鼓階內(nèi)可見血性物(圖1h)。

2.3毛細胞核DAPI染色結(jié)果

2.3.1暴露1周后空白組內(nèi)外毛細胞排列整齊，無核異常(圖2a)；失重組內(nèi)毛細胞排列略雜亂但無明顯核異常(圖2b)；噪聲組內(nèi)外毛細胞排列雜亂，外毛細胞存在較多腫脹，腫脹率為3.33%，尤以最外層外毛細胞為重(圖2c)；失重+噪聲組外毛細胞排列紊亂，存在更多核腫脹，腫脹率為10%(圖2d)。噪聲組大鼠外毛細胞腫脹率明顯高于失重組和空白組(P<0.01)，失重+噪聲組大鼠外毛細胞腫脹率明顯高于其余三組(P<0.01)。

2.3.2暴露2周后空白組內(nèi)外毛細胞排列整齊，無核異常(圖3a)；失重組內(nèi)毛細胞存在核缺失，外毛細胞排列整齊且無明顯核異常(圖3b)；噪聲組毛細胞排列雜亂，外毛細胞存在核缺失，缺失率約為12.7%，尤以最外層外毛細胞為重(圖3c)；失重+噪聲組外毛細胞排列紊亂，存在更多核缺失，缺失率為13.6%，最外層毛細胞缺失最嚴重(圖3d)。噪聲組大鼠外毛細胞缺失率明顯高于失重組和空白組(P<0.01)，失重+噪聲組大鼠外毛細胞缺失率高于其余三組(P<0.05)。

2.4電鏡觀察結(jié)果空白組大鼠基底膜底回毛細胞纖毛呈V型排列整齊，完整清晰(圖4a、4e)；失重組大鼠基底膜底回靜纖毛輕度散亂，偶有融合現(xiàn)象，內(nèi)毛細胞纖毛倒伏伴有缺失，內(nèi)層外毛細胞偶有缺失，暴露2周時比暴露1周時損傷大(圖4b、4f)；噪聲組靜纖毛明顯散亂，內(nèi)毛細胞纖毛倒伏明顯，最外層外毛細胞部分缺失(圖4c、4g)；失重+噪聲組靜纖毛散亂且有倒伏，外毛細胞靜纖毛大片缺失，以最外層最為明顯，暴露2周時比暴露1周時損傷明顯(圖4d、4h)。

3討論

Roller[1]、Buckey[6]等認為，噪聲是造成宇航員聽損傷的主要原因，載人航天器中都持續(xù)存在高強度噪聲，嚴重影響著工作人員的身體健康，其中以聽覺功能損傷最為嚴重。長時間暴露于噪聲中可能導致緩慢的進行性聽損傷，其損傷程度與噪聲強度、持續(xù)時間等因素有關(guān)[7]。失重作為飛行過程中同樣持續(xù)存在的環(huán)境，對聽力的損傷作用也不容忽視[8，9]。因此研究模擬失重和復合噪聲環(huán)境因素對聽損傷的作用有重要的現(xiàn)實意義。

本研究通過檢測ABR反應閾值判斷模擬失重和復合噪聲對大鼠聽功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噪聲組、失重+噪聲組比空白組和失重組ABR閾值高(P<0.01)，失重+噪聲組比噪聲組ABR閾值高(P<0.01)?？瞻捉M與噪聲組、失重+噪聲組，失重組與噪聲組、失重+噪聲組，噪聲組與失重+噪聲組之間ABR反應閾均有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。可見，單獨的模擬失重和單獨的復合噪聲對大鼠的聽力均有影響，其中復合噪聲影響較大。而綜合模擬失重和復合噪聲雙重因素的失重+噪聲組ABR閾值變化更大(P<0.01)，且失重+噪聲組的ABR閾值并不是失重組和噪聲組ABR閾值的簡單疊加，因此綜合因素對聽力造成的影響不是失重和噪聲兩種因素的簡單疊加，可能是兩種因素的協(xié)同作用。

Corti器是耳蝸的聽覺感受器，位于基底膜上，由毛細胞和支持細胞組成。本研究形態(tài)學實驗結(jié)果表明，模擬失重和復合噪聲對大鼠耳蝸毛細胞均有一定程度的損傷作用，主要表現(xiàn)在Corti器上。HE染色結(jié)果示暴露于失重和噪聲因素使得Corti器發(fā)生萎縮、紊亂。DAPI是一種特異性染料，能與DNA強力結(jié)合并區(qū)分凋亡和壞死細胞，凋亡細胞發(fā)生染色質(zhì)濃縮或核碎裂，染色后共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為胞核致密濃染或缺失，而壞死細胞表現(xiàn)為核腫脹，熒光顏色變淡。從文中毛細胞核的DAPI染色結(jié)果看，在復合噪聲環(huán)境下，外毛細胞較內(nèi)毛細胞更易受到損傷，損傷多發(fā)生于外毛細胞的最外層；而在單純的失重環(huán)境下，內(nèi)毛細胞更易發(fā)生缺失，與之前本課題組對豚鼠耳蝸的研究相符[4]。掃描電鏡觀察結(jié)果也支持以上結(jié)論：噪聲首先損傷Corti器的外毛細胞，可進一步累及內(nèi)毛細胞，暴露1周后的大鼠耳蝸毛細胞損傷以腫脹為主，暴露2周后毛細胞損傷以核缺失為主，可見，暴露于失重+噪聲復合環(huán)境下毛細胞存在壞死和凋亡兩種死亡方式，而暴露1周后毛細胞死亡以腫脹壞死為主，此時可能存在核凋亡但未超過生理過程中的正常凋亡水平；暴露于失重+噪聲復合環(huán)境2周后出現(xiàn)明顯的毛細胞核缺失，此時核缺失為毛細胞的非正常死亡，可能是由于高于生理過程中正常的凋亡水平造成的，也可能與強噪聲暴露后核的直接崩解壞死有關(guān)。國外有研究證實噪聲性(105～115 dB SPL)聽損傷與毛細胞的缺失密切相關(guān)，實驗中受損的毛細胞可能直接崩解死亡[10]，本文結(jié)果與此相符。本實驗中的形態(tài)學檢查與ABR閾值檢測結(jié)果相一致，因此，失重和噪聲均能造成毛細胞的非正常死亡，表現(xiàn)為核的腫脹或缺失。推測本研究中毛細胞的損傷主要由噪聲造成，失重使這種損傷更加嚴重，但毛細胞核的異常具體是由于凋亡還是壞死引起及凋亡的詳盡機制還有待進一步研究。

圖1　各組大鼠暴露1周和2周后耳蝸HE染色圖片(HE×100)

圖2　各組大鼠暴露1周后毛細胞核的免疫熒光染色圖片(DAPI×60)　↓示毛細胞腫脹

圖3　各組大鼠暴露2周后毛細胞核的免疫熒光染色圖片(DAPI×60)↓示毛細胞缺失

圖4　各組大鼠Corti器底回電鏡結(jié)果

a～d分別為暴露1周的空白組、失重組、噪聲組和失重+噪聲組；e～h分別為暴露2周的空白組、失重組、噪聲組和失重+噪聲組

4參考文獻

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(2015-07-17收稿)

(本文編輯周濤)

The Synergistic Effects of Simulated Microgravity and Noise Exposure on Damage of Auditory Function and Corti Organs in Rat

Wu Wei, Chen Na, Han Haolun, Wang Gang, Wang Hongnan,Zhou Libin, Li Baowei, Ding Ruiying

(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, 306thHospital of PLA, Beijing, 100010, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the synergistic effects of simulated microgravity and noise on the auditory functions and corti organs in rats. MethodsA total of 48 healthy rats were randomly divided into 4 groups (n=12)：control group (Group A), microgravity only group (Group B), noise only group (Group C) and microgravity+noise group (Group D). The microgravity environment was simulated by suspending the posterior limb using Morey-Holton method. The noise exposure was the simulation of the noise environment in spaceship including steady-state noise (72±2) dB SPL and impulse noise up to 160 dB SPL. The control group was kept in normal conditions without any exposure. Auditory brainstem responses (ABRs) , HE stainings, immunofluorescence stainings and scanning electron microscopes (SEMs) were tested after 1week and 2 weeks exposure respectively (n=6). ResultsThe average of ABR threshold shifts of 2 weeks exposure were higher than those of 1 week in each group. Group D showed the highest ABRs (P<0.01).The HE stainings showed different degrees of injury in corti organs in all experimental groups; which Group D being the most serious, followed by Group C.The results of immunefluorescence in hair cells showed that swelling necrosis was the main damage of cochlear hair cell after 1 week's exposure.The swelling rate of Group D was the highest, followed by Group C.Nucleus missing in hair cells was observed after 2 weeks' exposure. Group D had the highest missing rate and the main missing of Group B happened in the inner hair cells.SEM showed that the most serious damage of stereociliums in Group D,followed by Group C, then Group B.ConclusionThe synergistic effects of simulated microgravity and noise lead to significant damage of the auditory function and cochlea Corti organs in rat.

【Key words】Simulated microgravity;Noise;Corti organ;Auditory Brainstem Response (ABR)

【中圖分類號】R764.43+3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)02-0163-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.013

作者簡介：吳瑋，女，山東人，博士，主任醫(yī)師，研究方向為特種耳科學及臨床。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-2-116:18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160201.1618.008.html

*全軍十二五重大課題子課題(AWS11J003)資助

1解放軍306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(北京100101)