羅　靜　徐美青　郭明發(fā)　魏大中　柳常青　孫翔翔

(浙江醫(yī)院胸外科，浙江　杭州　310013)

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非小細(xì)胞肺癌組織中ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ的表達(dá)及意義

羅靜徐美青郭明發(fā)魏大中柳常青孫翔翔

(浙江醫(yī)院胸外科，浙江杭州310013)

〔摘要〕目的檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織中核切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC)1、糖核苷酸還原酶(RR)M1、β-微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ表達(dá)水平及其臨床意義。方法采用免疫組化法(SP二步法)對80例NSCLC患者腫瘤組織進(jìn)行ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ檢測，分析患者的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果80例NSCLC腫瘤組織中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ，蛋白表達(dá)陽性率分別為55.0%、42.5%和52.5%。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)陽性率與患者的性別、年齡、組織學(xué)類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性(P>0.05)；ERCC1、RRM1表達(dá)陰性的患者中位生存期及2年生存率分別均高于ERCC1,RRM1表達(dá)陽性的患者(P<0.05)；β-tubulinⅢ表達(dá)與否對NSCLC患者中位生存期及2年生存率無明顯影響(P>0.05)，結(jié)論免疫組化方法檢測ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ的蛋白表達(dá)情況有助于篩選NSCLC患者輔助化療藥物，并且對判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

〔關(guān)鍵詞〕ERCC1；RRM1；β-tubulinⅢ；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是目前我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，約80%診斷為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，手術(shù)是Ⅰ~Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者主要的治療方法之一，雖術(shù)后予以輔助化療，但生存率改善不佳，有研究表明5年生存率較前僅改善5%左右〔1,2〕。隨著基因分子診斷技術(shù)的發(fā)展，依據(jù)檢測結(jié)果為肺癌患者選擇合適的化療方案，來提高療效，延長生存期，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)核切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)、糖核苷酸還原酶M1(RRM1)、β微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)等表達(dá)水平與化療藥物療效及預(yù)后密切相關(guān)，本研究采用免疫組化方法檢測ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)，探討三者與NSCLC臨床和病理特征的關(guān)系以及對患者預(yù)后的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2010年5月至2011年1月安徽省立醫(yī)院胸外科手術(shù)治療且術(shù)后行輔助化療的Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者80例，男49例，女31例，年齡40～72歲；病理類型：鱗癌41例，腺癌39例；臨床Ⅰ期為36例，Ⅱ期為29例，Ⅲ期為15例；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移29例，有轉(zhuǎn)移51例。其中8例Ⅰ期患者未化療，其余72例患者均化療，化療方法：采用GP方案者24例(GP方案：吉西他濱1 g/m2第1,8天+順鉑75 mg/m2)，采用TP方案者32例(TP方案：多西他賽100 mg/m2+順鉑75 mg/m2)，采用NP方案者16例(NP方案：長春瑞濱25 mg/m2第1，5天+順鉑75 mg/m2)，連續(xù)4~6周期?；颊咦允中g(shù)后開始隨訪，在進(jìn)行隨訪，末次隨訪時(shí)間為2013年5月30日。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟一抗：ERCC1抗體(稀釋比例1∶100)和β-tubulin Ⅲ抗體(稀釋比例1∶100)購自北京中杉公司。RRM1抗體(稀釋比例1∶100)購自福建邁新公司。二抗和S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。取上述80例患者手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋，切片厚4 μm；常規(guī)經(jīng)二甲苯，無水酒精脫蠟，水化組織切片， 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×3 min ；在30%H2O2細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶(約30 min) ，暴露抗原決定族,封閉非特異；一抗孵育，放入濕盒中37℃1 h或4°過夜，二抗孵育(約30 min)，PBS 洗5次×5 min；SP反應(yīng)，在37℃ 30 min，DAB顯色系統(tǒng)顯色，加滴蘇木素染液復(fù)染后脫水、封片 。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)采取組織化學(xué)評分法，采用10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的陽性比例腫瘤細(xì)胞表達(dá)數(shù)1%~9%，計(jì)分0.1；10%~49%計(jì)分0.5；>50%計(jì)分1，并根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度(0、1、2、3分)，二者分?jǐn)?shù)相乘為該標(biāo)本的最終得分，根據(jù)得分情況，劃定高表達(dá)及低表達(dá)。

1.4預(yù)后評價(jià)生存期為治療開始至死亡或隨訪結(jié)束的時(shí)間；計(jì)算中位生存期及2年生存率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用Log-rank比較生存率。

2結(jié)果

2.1ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC中的表達(dá)ERCC1陽性細(xì)胞染色為細(xì)胞核染色呈黃色，RRM1及β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)染色呈黃色，見圖1。

圖1　NSCLC中ERCC1、 RRM1、β-tubulinⅢ 的免疫組化表達(dá)(DAB，×40)

2.2ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系80例NSCLC患者中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ陽性表達(dá)率分別為55%(44/80)、 42.5%(34/80)、52.5%(42/80)。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達(dá)與年齡、性別、期別、病理類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性(P>0.05),見表1。

表1　ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ與

2.3ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達(dá)在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性ERCC1和RRM1的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.040)，RRM1和β-tubulinⅢ的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.019)，ERCC1和β-tubulinⅢ的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.027)。

2.4ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達(dá)與生存期之間的關(guān)系44例ERCC1陽性患者中，中位總生存期18.6個(gè)月，2年生存率為49.6%，36例ERCC1陰性的患者中，中位總生存期22.4個(gè)月，2年生存率為58.7%，ERCC1陰性患者中位總生存期明顯長于ERCC1陽性患者(P=0.043)，Ⅰ期ERCC1陽性和陰性患者的中位生存期分別是33.4個(gè)月33.1個(gè)月，Ⅱ期和Ⅲ期ERCC1陰性中接受鉑類化療的患者的中位生存期明顯高于陽性患者，Ⅱ期ERCC1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是26.4個(gè)月和23.5個(gè)月,Ⅲ期ERCC1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是19.4個(gè)月和16.3個(gè)月。34例RRM1陽性患者中，中位總生存期18.9個(gè)月，2年生存率為42.5%，46例RRM1陰性患者中,中位總生存期21.6個(gè)月，2年生存率為59.4%，RRM1陰性患者中位總生存期明顯長于RRM1陽性者(P=0.034)，Ⅰ~Ⅲ期RRM1陰性患者的中位生存期明顯高于陽性患者，Ⅰ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是個(gè)34.1個(gè)月和31.6個(gè)月，Ⅱ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是25.2個(gè)月和22.5個(gè)月,Ⅲ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是個(gè)18.2月和16.0個(gè)月。42例β-tubulinⅢ陽性患者中,中位總生存期18.1個(gè)月，2年生存率為44.1%，38例β-tubulinⅢ陰性患者中,中位生存期19.4個(gè)月，2年生存率為49.7%，β-tubulinⅢ陰性患者中位總生存期與β-tubulinⅢ陽性者無差別(P=0.94)，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ陰性和陽性患者的中位生存期分別是：33.5個(gè)月，26.0個(gè)月，17.3個(gè)月和32.9個(gè)月，27.1個(gè)月，16.8個(gè)月。

3討論

目前肺癌術(shù)后治療以化療為主，因個(gè)體之間的差異性，不同病理類型和分期的肺癌患者，對標(biāo)準(zhǔn)化療敏感性差異較大，因此近年來提出了針對不同患者進(jìn)行個(gè)體化治療的概念通過檢測ERCC1、RRM1 、β-tubulinⅢ基因表達(dá)，表皮生長因子受體(EGFR)等基因體細(xì)胞突變等分子標(biāo)記物，來進(jìn)行制定個(gè)體化治療方案，提高化療效率，并具有預(yù)測預(yù)后的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)陽性率與患者的臨床特征均無明顯相關(guān)性，并顯示ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)兩兩之間呈正相關(guān)，可作為指導(dǎo)臨床的標(biāo)志物。

ERCC1是DNA損傷修復(fù)途徑中最主要的基因之一，則具有損傷識別和切除5’端的雙重作用，在核苷酸切除修復(fù)中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用，是DNA修復(fù)的一個(gè)重要途徑。鉑類藥物抗腫瘤作用的主要靶點(diǎn)為DNA，其細(xì)胞毒性主要在于與細(xì)胞內(nèi)親核DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，影響DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其致命損傷。ERCC1作為核苷酸切除修復(fù)的限速酶參與DNA的修復(fù)并且有可能作為使用鉑類化療藥的預(yù)測的標(biāo)記物〔3〕，Simon等〔4〕根據(jù)ERCC1基因表達(dá)水平進(jìn)行研究，結(jié)果證明ERCC1低表達(dá)者用鉑類治療，ERCC1高表達(dá)者用非鉑治療，可以提高肺癌治療的有效率。ERCC1基因表達(dá)及多態(tài)性與NSCLC的發(fā)病、臨床特點(diǎn)、生物學(xué)行為、預(yù)后等存在一定的相關(guān)性〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)ERCC1基因蛋白表達(dá)陰性其中位生存期及2年生存率明顯好于陽性患者(P=0.043)，與Vilmar等〔6〕研究結(jié)果相似。Olaussen等〔7〕報(bào)道提示對于早期肺癌患者ERCC1表達(dá)陽性具有保護(hù)作用，對于ERCCI陰性的患者隨機(jī)接受輔助化療明顯延長生存時(shí)間，本研究Ⅰ~Ⅲ期ERCC1陰性患者接受化療ERCC1低表達(dá)患者生存期長于ERCC1高表達(dá)者與其相符。對于正常人群，DNA修復(fù)基因可以降低肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而對于肺癌患者，DNA修復(fù)基因可以導(dǎo)致化療藥物的耐藥，使化療療效降低。

RRM1是RNA合成的前體，它能使核糖核苷酸還原成為脫氧核糖核苷酸，是DNA 合成通路中的限速酶，是鹽酸吉西他濱(GEM)耐藥的一個(gè)重要預(yù)測指標(biāo) 。吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過核苷激酶的作用轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)，通過抑制DNA合成而發(fā)揮細(xì)胞毒作用，吉西他濱干擾了核苷酸還原酶的功能，因此推測RRM1的表達(dá)可能與吉西他濱耐藥有關(guān)。Zheng等〔8〕研究RRM1在體內(nèi)外的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RRM1在腫瘤組織當(dāng)中高表達(dá)對鉑類+吉西他濱化療治療中具有重要的預(yù)測指標(biāo)。Rosell等〔9〕檢測了100例GEM 方案治療的晚期NSCLC患者標(biāo)本的RRM1 mRNA發(fā)現(xiàn)RRM1 mRNA低表達(dá)者明顯受益，中位生存期高于高表達(dá)者。國外研究〔10〕發(fā)現(xiàn)早期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后RRM1患者高表達(dá)提示預(yù)后較好，而晚期接受GP方案化療的患者RRM1高表達(dá)提示預(yù)后較差，國內(nèi)外文獻(xiàn)顯示RRM1的基因表達(dá)與吉西他濱耐藥相關(guān)，肺癌患者RRM1高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者較難從吉西他濱與鉑類聯(lián)合化療中獲益。本研究也證實(shí)早期RRM1陽性表達(dá)組的中位生存期長于RRM1陰性，而晚期接受化療的RRM1陰性表達(dá)組的中位生存期明顯長于陽性表達(dá)組,RRM1的表達(dá)情況同肺癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為、腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后存在相關(guān)關(guān)系。

β-tubulinⅢ蛋白是一類微管蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，在細(xì)胞有絲分裂當(dāng)中起重要作用，研究表明其表達(dá)對紫杉類耐藥有關(guān)。國外對NSCLC術(shù)后病理進(jìn)行免疫組化檢查，結(jié)果顯示β-tubulinⅢ表達(dá)對紫杉醇具有相關(guān)性，可作為重要生物標(biāo)記物預(yù)測多西他賽的敏感性，Seve等〔11〕臨床研究分析顯示β-tubulinⅢ高表達(dá)者預(yù)后差，但較低表達(dá)者似乎更能從鉑類+紫杉醇的輔助化療中獲益，另一研究表明分組給予紫杉類加鉑類，或者吉西他濱加鉑類方案，結(jié)果顯示β-tubulinⅢ低表達(dá)組對紫杉加鉑類的受益程度明顯高于高表達(dá)組及吉西他濱組。Reiman等〔12〕研究β-tubulinⅢ陽性者在早期非小細(xì)胞肺癌具有預(yù)測性作用，β-tubulinⅢ高表達(dá)時(shí)可從長春瑞濱加順鉑的輔助化療中獲益；而低表達(dá)時(shí)可從紫杉加鉑類的化療中獲益。Dumontet等〔13〕在β-tubulinⅢ表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，β-tubulinⅢ高水平表達(dá)患者的無疾病生存期明顯低于低表達(dá)者，Vilmar等〔14〕也報(bào)道，β-tubulinⅢ低水平表達(dá)患者有著更長的無疾病生存期，及更高的總生存率，是重要的預(yù)測指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，β-tubulinⅢ性高表達(dá)與低表達(dá)比較時(shí)，患者中位生存期和2年生存率較為陰性者未見明顯降低，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ陰性和陽性患者的中位生存期未見明顯差異(P>0.05)，雖與上述研究存在一定差異，但本研究不能評價(jià)對多西他賽敏感性的關(guān)系。

肺癌的發(fā)生與發(fā)展過程當(dāng)中包含了多種基因的表達(dá)，并且一些基因與腫瘤耐藥有關(guān)，本研究回顧性分析ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ三者關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三者呈明顯的正相關(guān)性，這可能與肺癌的發(fā)生，發(fā)展有著密切的關(guān)系，此外研究證實(shí)ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ等分子標(biāo)志物的表達(dá)狀態(tài)可能僅對化療的療效及預(yù)后有一定預(yù)測價(jià)值，而ERCC1，RRM1的低表達(dá)具有更長的生存期。因此對ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因蛋白的檢測，具有臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1113-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.042

通訊作者：徐美青(1962-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事胸外科疾病研究。

基金項(xiàng)目：衛(wèi)生部分子診斷技術(shù)在肺癌個(gè)體化治療中的應(yīng)用研究課題資助項(xiàng)目(No.W2012F115)

第一作者：羅靜(1985-)，男，碩士，主要從事胸外科疾病研究。