劉　珂　阮林海

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南　洛陽(yáng)　471003)

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間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)老年慢性粒細(xì)胞白血病患者免疫調(diào)節(jié)功能的影響

劉珂阮林海

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南洛陽(yáng)471003)

〔摘要〕目的分析老年慢性粒細(xì)胞白血病(CML)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的免疫調(diào)節(jié)功能。方法老年CML患者15例，同時(shí)選取正常人來(lái)源的MSC 12例，評(píng)估T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果兩組細(xì)胞的形態(tài)與免疫表型差異不明顯，相對(duì)正常人，CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞增殖有減輕抑制作用，而對(duì)抑制T細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。在正常對(duì)照的MSC與PHA 刺激的單核細(xì)胞比例為1∶3時(shí)，可抑制T細(xì)胞增殖5%以下，而當(dāng)CML骨髓來(lái)源的MSC與PHA 刺激的單核細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可抑制T細(xì)胞增殖比例為45%；CML骨髓來(lái)源的MSC與T細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)凋亡率上升明顯，CD25、CD44、CD29凋亡率各自達(dá)到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，對(duì)比正常人來(lái)源的MSC與經(jīng)PHA誘發(fā)的T細(xì)胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CD25、CD44、CD29綜合凋亡率為(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%。結(jié)論老年CML患者進(jìn)行移植時(shí)應(yīng)選用正常人干細(xì)胞,有利于保護(hù)血液系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能。

〔關(guān)鍵詞〕間充質(zhì)干細(xì)胞；慢性粒細(xì)胞白血??；免疫調(diào)節(jié)

白血病是臨床常見(jiàn)的惡性血液病，常造成患者貧血、全身感染導(dǎo)致死亡〔1〕。而其中以慢性粒細(xì)胞白血病(CML)最為嚴(yán)重，對(duì)體內(nèi)造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)損傷最明顯。造血干細(xì)胞可產(chǎn)生一系列血液因子，而傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞僅能刺激紅細(xì)胞和白細(xì)胞系的產(chǎn)生，從而忽略了細(xì)胞自身功能〔2〕。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能不僅在血液系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，同時(shí)其免疫調(diào)節(jié)作用也有利于疾病的治療。這種免疫調(diào)節(jié)作用可損害正常T細(xì)胞的生理代謝及作用發(fā)揮，T細(xì)胞數(shù)量減少，最終組織的功能減退，出現(xiàn)一系列免疫系統(tǒng)疾病〔3,4〕。本文對(duì)比正常人與老年CML患者骨髓的MSC的免疫調(diào)節(jié)功能。

1資料與方法

1.1一般資料2011年3月至2013年10月我院老年CML患者，男9例，女6例；年齡61~77歲，平均(66.2±2.3)歲?；颊咧g的年齡、職業(yè)、病史、住院時(shí)間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。診斷均符合臨床通用的CML診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確診，排除易引起混淆的其他疾病如淋巴瘤、小細(xì)胞性貧血、脾功能亢進(jìn)等。再隨機(jī)選取正常人12例，其中男7例，女5例，年齡60~75歲，平均(64.8±2.7)歲。

1.2MSC培養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境中采集骨髓10~20 ml置于事先清洗的試管中，隨后轉(zhuǎn)移至放入細(xì)胞分離液及稀釋劑的離心管內(nèi)，比例控制在1∶2?；靹蚝笾糜趧蛩匐x心機(jī)中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，設(shè)定2 000 r/min的轉(zhuǎn)速，時(shí)間為30 min〔6〕。隨后在白膜層進(jìn)行試管的吸取，最終得出單個(gè)細(xì)胞，選用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌后進(jìn)行計(jì)數(shù)及分類(lèi)處理，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，生長(zhǎng)過(guò)程中密切觀察形態(tài)，定期清理培養(yǎng)中懸浮物及更換培養(yǎng)液。最終待細(xì)胞融合后收集干細(xì)胞，進(jìn)行低溫貯存。

1.3免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞免疫表型的測(cè)定收集完成的MSC進(jìn)行分離后，充分洗滌以保證成分的唯一性，采用流式細(xì)胞儀中免疫熒光法測(cè)定。其中細(xì)胞內(nèi)抗原Flk-1需要破壞細(xì)胞膜，故取適量細(xì)胞加入10%甲醛水溶液5℃下進(jìn)行處理，最后使用Flk-1單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)；而其他細(xì)胞因子包括CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR等，僅需分離純化后加入相應(yīng)單克隆抗體進(jìn)行逐一檢測(cè)〔7〕。最終將細(xì)胞貯存于低溫環(huán)境中。

1.4MSC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響對(duì)于正常人及MSC患者的外周血進(jìn)行培養(yǎng)，采用離心法進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的分離，放入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h后獲取上層細(xì)胞，放入含RPMI1640培養(yǎng)基的中性細(xì)胞孔，每組培養(yǎng)3孔以保證準(zhǔn)確性，保證在10%CO2且濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)，3 d后進(jìn)行觀察。隨后按照研究順序分為4組實(shí)驗(yàn)：①空白對(duì)照組：僅加入T細(xì)胞而不加入細(xì)胞刺激因子；②反應(yīng)對(duì)照組：加入T細(xì)胞后，同時(shí)加入刺激因子；③正常組：加入正常人MSC，保證MSC與T細(xì)胞比例在1∶10；④CML組：加入CML患者的MSC。培養(yǎng)完畢后加入35×103的3H-Tdr(來(lái)源于北京市放射與核醫(yī)學(xué)研究所)進(jìn)行計(jì)數(shù)，取各孔之間的平均數(shù)作為最終結(jié)果〔8〕。

1.5混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)刺激性T細(xì)胞與T細(xì)胞進(jìn)行誘發(fā)性混合淋巴反應(yīng)時(shí)，可分為4組進(jìn)行研究：①空白對(duì)照組：反應(yīng)過(guò)程中不加入刺激性T細(xì)胞而僅加入T細(xì)胞；②反應(yīng)對(duì)照組：反應(yīng)中加入T細(xì)胞，同時(shí)加入刺激性T細(xì)胞作為激發(fā)因子；③正常組：在T細(xì)胞及刺激性T細(xì)胞的基礎(chǔ)上額外加入正常人的MSC，其中MSC與T細(xì)胞的比例維持在1∶10以起到最佳反應(yīng)效果；④CML組：在T細(xì)胞及刺激性T細(xì)胞的基礎(chǔ)上額外加入CML患者的MSC，其中MSC與T細(xì)胞的比例依然為1∶10。檢測(cè)方法相同，觀察反應(yīng)結(jié)果〔9〕。

1.6MSC對(duì)T細(xì)胞周期的影響正常MSC與T細(xì)胞保持1∶10的比例時(shí)抑制作用最明顯，故研究中始終維持此比例。采用加入3T3細(xì)胞組進(jìn)行對(duì)比，各組均加入刺激因子，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后采集反應(yīng)細(xì)胞，采用無(wú)水酒精浸泡1 h以進(jìn)行細(xì)胞固定，隨后選用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，染色后選用細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，運(yùn)用冷凍法保證細(xì)胞周期計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。細(xì)胞周期定義為從一次分裂結(jié)束后到下一次分裂結(jié)束為止，注意區(qū)分細(xì)胞分裂的間期與分裂期，計(jì)數(shù)應(yīng)準(zhǔn)確。若同一細(xì)胞存在不同結(jié)果時(shí)，以合理范圍內(nèi)細(xì)胞周期相對(duì)較長(zhǎng)者為最終結(jié)果。

1.7MSC對(duì)T細(xì)胞活化的影響按照前述的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分離出單個(gè)核的細(xì)胞，加入細(xì)胞刺激因子進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)，其后分別混合正常人和CML、MSC進(jìn)行共同培養(yǎng)，維持1∶10的研究比例，T細(xì)胞活性指標(biāo)選用細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)所得的細(xì)胞因子表達(dá)指標(biāo)，且不同細(xì)胞因子進(jìn)行不同時(shí)間的觀察。24 h內(nèi)進(jìn)行CD28的觀測(cè)，48 h進(jìn)行CD45的觀測(cè)，最終7 d后進(jìn)行CD72的表達(dá)測(cè)定，從多細(xì)胞因子的共同效應(yīng)反映活化情況。

1.8MSC對(duì)T細(xì)胞凋亡的影響凋亡的檢測(cè)采取Amanex計(jì)數(shù)法，在200 ml細(xì)胞懸液中均勻加入細(xì)胞并進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。選用前述方法進(jìn)行正常人和CML培養(yǎng)并進(jìn)行單個(gè)核的分離，加入細(xì)胞刺激因子后進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)與T細(xì)胞的混合培養(yǎng)，5 d后通過(guò)Amanex-V指標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，具體步驟為：①使用配置好的PBS進(jìn)行細(xì)胞沖洗，采用linger液進(jìn)行細(xì)胞的固定懸浮，進(jìn)行細(xì)胞濃度的調(diào)整，保持在2×106/ml；②選取200 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，加入Amanex-V試劑，混勻進(jìn)行反應(yīng)；③固定1 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)量下降40%為凋亡明顯的標(biāo)志，統(tǒng)計(jì)兩組細(xì)胞的凋亡比例〔10〕。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件行t及χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC形態(tài)及免疫表型對(duì)比在光鏡下觀察正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC形態(tài)無(wú)明顯差異，雖然分布略有不同，但均呈成纖維細(xì)胞樣附著于管壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間生長(zhǎng)排列整齊，不具有特異性差異。檢驗(yàn)兩種細(xì)胞的免疫表型，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子指標(biāo)中表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)的包括Flk-1及黏附因子CD29、CD44、CD105和CD106，陰性包括CD34、CD45、HLA-DR。故正常人和CML來(lái)源的MSC在形態(tài)及免疫表型上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞增殖作用比較正常對(duì)照的結(jié)果與既往類(lèi)似，而患者的增殖抑制作用減弱，且根據(jù)有無(wú)刺激和刺激因子分為三組。在正常對(duì)照的MSC與PHA 刺激的單核細(xì)胞比例為1∶3時(shí)，可抑制T細(xì)胞增殖5%以下，而當(dāng)CML骨髓來(lái)源的MSC與PHA 刺激的單核細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可抑制T細(xì)胞增殖的比例為45%；而在比例提升至1∶10及1∶100時(shí)此現(xiàn)象更明顯。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，結(jié)果與之類(lèi)似。相對(duì)正常人，CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞增殖有減輕抑制作用，且MSC比例越大時(shí)這種減輕抑制作用越明顯。見(jiàn)圖1。

圖1　正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞增殖作用

2.3正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞周期作用比較選用正常人MSC與T細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可抑制T細(xì)胞正常周期，而選用CML骨髓來(lái)源MSC發(fā)現(xiàn)這種抑制作用減弱，具體表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞在增殖周期中大多數(shù)傾向于停留于G0/G1期，而少數(shù)傾向于S期，而分裂間期的縮短即可導(dǎo)致T細(xì)胞周期縮短。發(fā)現(xiàn)CML來(lái)源患者中此種趨勢(shì)不明顯，具有減弱的作用。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性選用3T3細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)3T3細(xì)胞改變T細(xì)胞增殖周期的作用不明顯。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性采用T3組、3T3+Ts組作為對(duì)照，重點(diǎn)關(guān)注MSC+Ts與CML MSC+Ts的結(jié)果推測(cè)T細(xì)胞周期改變并根據(jù)對(duì)照組排除無(wú)關(guān)因素。見(jiàn)圖2。

圖2　正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞周期作用

2.4正常人和CML骨髓來(lái)源的MSC對(duì)T細(xì)胞凋亡作用比較CML骨髓來(lái)源的MSC與T細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)凋亡率上升明顯，CD25、CD44、CD29凋亡率各自達(dá)到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，對(duì)比正常人來(lái)源的MSC與經(jīng)PHA誘發(fā)的T細(xì)胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CD25、CD44、CD29綜合凋亡率為(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%(t值分別為5.55、8.51、4.66，均P<0.05)。PHA刺激3 d后，T細(xì)胞凋亡率為(23.37±2.71)%，和正常的MSC共培養(yǎng)時(shí)為(14.1±0.65)%，而和骨髓增生異常綜合征患者來(lái)源的MSC共培養(yǎng)時(shí)為(8.36±1.31)%。CML來(lái)源的MSC可以加強(qiáng)干細(xì)胞抑制T細(xì)胞凋亡的作用。CML來(lái)源的MSC除抑制T細(xì)胞增殖和活化的能力減弱外，其抑制T細(xì)胞凋亡的能力亦增強(qiáng)。

3討論

白血病是影響當(dāng)代人群存活率的一種常見(jiàn)惡性病癥，近年來(lái)發(fā)病率和死亡率日益增加，而近年來(lái)CML研究日益增多〔11〕。而以對(duì)抗貧血及誘發(fā)造血為目的的傳統(tǒng)治療效果并不明顯，無(wú)法長(zhǎng)久維持患者造血功能，且產(chǎn)生一系列免疫系統(tǒng)問(wèn)題〔12〕。目前探究CML發(fā)病機(jī)制可發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)損害及免疫功能異常為影響發(fā)病的主要因素，CML往往合并免疫系統(tǒng)疾病，因此近年來(lái)考慮從MSC入手進(jìn)行治療，維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性〔13〕。體內(nèi)正常存在的MSC比例較小，其免疫調(diào)節(jié)功能易被忽略，但在免疫療法中，可以通過(guò)外界輸入等方法增加體內(nèi)免疫細(xì)胞中MSC的比例，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，此方法適應(yīng)證廣泛，既往已在器官移植等免疫反應(yīng)中進(jìn)行應(yīng)用〔14〕。當(dāng)MSC與T細(xì)胞比例在1∶100以上時(shí)，可忽略此種免疫效應(yīng)而加大MSC比例時(shí)，在激活造血系統(tǒng)進(jìn)行血液成分的再生之外還可非特異性修復(fù)免疫系統(tǒng)，減少因突變、腫瘤等因素對(duì)于免疫功能的破壞。MSC這種免疫功能可在體內(nèi)或體外進(jìn)行，其分布部位反映微環(huán)境位點(diǎn)。而目前考慮可用MSC抑制T細(xì)胞增殖、周期，而增強(qiáng)T細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行CML治療〔15〕。尤其對(duì)于免疫系統(tǒng)功能低下、造血功能喪失的血液系統(tǒng)疾病具有更大優(yōu)勢(shì)。

正常人MSC對(duì)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及凋亡有抑制作用，而CML、MSC對(duì)T細(xì)胞的影響發(fā)生了一定改變。雖然在形態(tài)和免疫表型上兩種MSC差異不明顯，但CML患者M(jìn)SC對(duì)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期的抑制下降而對(duì)T細(xì)胞凋亡的抑制作用增強(qiáng)，故難以維持體內(nèi)免疫環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，容易產(chǎn)生自身免疫病等不良后果，故不建議進(jìn)行自體移植。研究結(jié)束后可進(jìn)行安全性分析，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞研究中均出現(xiàn)了一定的誤差性研究結(jié)果。主要包括細(xì)胞形態(tài)不清、增殖異常、凋亡明顯等。誤差性結(jié)果相對(duì)輕微，且在兩組細(xì)胞的研究中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)后續(xù)研究干擾較小。

綜上，CML發(fā)病時(shí)免疫調(diào)節(jié)功能缺失，骨髓MSC移植可以改善骨髓微環(huán)境和調(diào)節(jié)體內(nèi)異常的免疫狀態(tài)，有利于維持血液系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能，減少合并不良反應(yīng)的發(fā)生〔16〕。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R394.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1063-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.018

第一作者：劉珂(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事血液學(xué)研究。