賈雪麗　皇甫明美　閆文星　徐　爽　邱　爽　孫世龍　劉林林

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　130041)

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CIK對(duì)卵巢癌及其耐藥細(xì)胞的殺傷作用

賈雪麗皇甫明美閆文星徐爽邱爽1孫世龍1劉林林

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130041)

〔摘要〕目的探討細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)對(duì)卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)及其耐藥細(xì)胞(SKVCR)的體外殺傷效應(yīng)。方法用健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在體外應(yīng)用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)成CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析其表型特征，CIK分別作用于SKOV3及SKVCR 24 h和48 h后，CCK8法檢測(cè)不同效靶比下的細(xì)胞吸光度(A)值并計(jì)算CIK對(duì)各組細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果CIK細(xì)胞對(duì)SKOV3及SKVCR的殺傷效應(yīng)隨效靶比的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.05)。在同一作用時(shí)間、相同效靶比時(shí)，CIK細(xì)胞對(duì)于SKOV3和SKVCR的殺傷效應(yīng)差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論CIK對(duì)卵巢癌及其耐藥細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

〔關(guān)鍵詞〕卵巢腫瘤；多重耐藥；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞

卵巢癌目前尚無有效的篩查方法，多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是晚期卵巢癌的重要治療手段，但由于化療毒副作用較大及耐藥性的出現(xiàn)，導(dǎo)致卵巢癌的化療效果受限。隨著免疫細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的迅速發(fā)展，免疫治療(特別是過繼性細(xì)胞免疫治療)發(fā)揮越來越重要的作用。本研究旨在探討CIK對(duì)卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)及其耐藥細(xì)胞(SKVCR)的體外殺傷效應(yīng)，為卵巢癌綜合治療新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器淋巴細(xì)胞分離液( Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)；α-MEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；抗人CD3單克隆抗體(Sigma公司)；重組人干擾素(上海生物制品所)；白細(xì)胞介素-2(北京四環(huán)生物工程制品廠)；anti-hunman CD3-FITC、CD56-PE(BD公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；-70℃深低溫冰箱(SNAYO公司)；CO2培養(yǎng)箱(SNAYO公司)；無菌超凈工作臺(tái)(江蘇凈化設(shè)備廠)；FACSort flow cytometer(Becton Dickinson公司)；酶標(biāo)儀(KCjunior公司)。

1.2細(xì)胞株人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及其耐藥細(xì)胞SKVCR為吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，均使用α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS及青霉素與鏈霉素各100 U/ml)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKVCR是由SKOV3以逐漸增加長(zhǎng)春新堿藥物劑量誘導(dǎo)而成，耐藥濃度為2 μg/ml。經(jīng)檢測(cè)SKVCR不僅對(duì)長(zhǎng)春新堿產(chǎn)生耐藥，對(duì)其他不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的化療藥物(如吡柔比星、依托泊苷)也產(chǎn)生了交叉耐藥〔1〕。

1.3效應(yīng)CIK細(xì)胞的制備CIK的制備參考相關(guān)文獻(xiàn)〔2〕，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法提取健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。2 h后收集非貼壁細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106/ml，加入1 000 U/ml干擾素(IFN)-γ繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后加入50 ng/ml anti-human CD3、1 000 U/ml IL-2，以后每3 d添加一次培養(yǎng)液，并補(bǔ)足IL-2。于培養(yǎng)第14天收取CIK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，測(cè)定CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞百分比。

1.4CCK8法測(cè)定CIK細(xì)胞對(duì)SKOV3和SKVCR的殺傷作用取培養(yǎng)第14天收獲的CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、SKVCR為靶細(xì)胞。調(diào)整靶細(xì)胞濃度為8×104/ml，100 μl加入96孔平底培養(yǎng)板于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后按照不同實(shí)驗(yàn)組別給予相應(yīng)處理：A1～4為CIK殺傷SKOV3細(xì)胞組，B1～4為CIK殺傷SKVCR細(xì)胞組；每組中1～4的效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1，按照不同的效靶比加入不同濃度CIK細(xì)胞100 μl。同時(shí)設(shè)空白培養(yǎng)液(空白組)、單獨(dú)靶細(xì)胞(靶細(xì)胞組)作不同濃度效應(yīng)細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞組)作對(duì)照孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μl。置于培養(yǎng)箱中24 h和48 h取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入CCK8每孔20 μl低速振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶標(biāo)儀設(shè)置測(cè)量波長(zhǎng)490 nm、參考波長(zhǎng)610 nm，測(cè)各孔吸光度值(A值)。殺傷作用(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞組A值)/(靶細(xì)胞組A值-空白組A值)〕×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1CIK細(xì)胞的制備本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)至第14天時(shí)的CIK細(xì)胞，此時(shí)獲得大量增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD3+CD56+細(xì)胞所占比例達(dá)45.8%。

2.2各組CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用見表1。在同一靶細(xì)胞、作用時(shí)間相同的條件下，不同效靶比CIK細(xì)胞作用組對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，

表1　CIK對(duì)SKOV3和SKVCR細(xì)胞的殺傷作用

隨著效靶比的增加，殺傷作用隨之增強(qiáng)；各組內(nèi)不同作用時(shí)間CIK對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷率之間存在顯著性差異(P<0.05)，在24～48 h，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)。值得注意的是本實(shí)驗(yàn)所研究的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和其耐藥細(xì)胞株SKVCR在同一作用時(shí)間、同一效靶比時(shí)，CIK對(duì)它們殺傷作用的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

CIK細(xì)胞既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抑瘤活性，又具有自然殺傷(NK)細(xì)胞非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)，所以又被稱為自然殺傷細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞〔3，4〕。近年來出現(xiàn)的過繼性細(xì)胞免疫治療包括LAK、TIL、CTL、DC和CIK，與其他類型細(xì)胞免疫治療相比，CIK具有增殖活性高，殺瘤作用強(qiáng)，殺傷范圍廣，毒性作用輕微等優(yōu)點(diǎn)。CIK細(xì)胞已被應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)〔5〕、消化系統(tǒng)〔6〕、血液系統(tǒng)〔7〕等腫瘤患者的臨床治療，均取得較好的療效。

CIK 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：①通過釋放顆粒酶或穿孔素，對(duì)腫瘤細(xì)胞直接發(fā)揮殺傷作用。②CIK 細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子(如IL-2、 IFN-γ、TNF-α等)，直接殺傷或通過增強(qiáng)細(xì)胞毒作用間接殺傷腫瘤細(xì)胞。③有研究表明，經(jīng)過CIK治療后腫瘤患者外周血中調(diào)節(jié)T細(xì)胞較治療前明顯降低〔8〕，說明CIK細(xì)胞免疫治療可以提高患者的免疫功能，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮間接殺傷作用。④CIK 細(xì)胞通過與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Ⅰ型跨膜糖蛋白結(jié)合，或通過下調(diào)凋亡抑制基因、上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死。

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性的產(chǎn)生是臨床腫瘤化療失敗的原因之一，根據(jù)耐藥表型的不同，可以分為原藥耐藥和多藥耐藥。其中，多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的主要耐藥形式，可以影響包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌及胃癌等大部分腫瘤的治療效果〔9〕。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某一抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他未接觸的、作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在一定范圍內(nèi)CIK對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和其多藥耐藥細(xì)胞SKVCR的殺傷率隨效靶比的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一作用時(shí)間、相同效靶比時(shí)，CIK細(xì)胞對(duì)于SKOV3和SKVCR的殺傷作用無明顯差別，這將有助于卵巢癌尤其是對(duì)化療不敏感的卵巢癌患者抗腫瘤治療新策略的制定。CIK細(xì)胞已成為腫瘤過繼免疫治療的主力軍，是繼手術(shù)、放療和化療之后輔助治療的重要手段之一。

4參考文獻(xiàn)

1梁冰.抑制自噬增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞放化療敏感性的體外研究〔D〕.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

2Tan G，Zhang X，F(xiàn)eng H，etal.The therapeutic effect of cytokine-induced killer cells on pancreatic cancer enhanced by dendritic cells pulsed with K-ras mutant peptide〔J〕.Clin Dev Immunol，2011；2011：649359.

3Pievani A，Borleri G，Pende D，etal.Dual-functional capability of CD3+CD56+CIK cells，a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity〔J〕.Blood，2011;118(12)：3301-10.

4Mesiano G，Todorovic M，Gammaitoni L，etal.Cytokine-induced killer(CIK)cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors〔J〕.Expert Opin Biol Ther，2012;12(6)：673-84.

5Li R，Wang C，Liu L，etal.Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer：a phase Ⅱ clinical study〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2012;61(11)：2125-33.

6孫明芳，丁震宇，謝曉冬，等.化療聯(lián)合自體CIK細(xì)胞治療晚期胃癌的隨機(jī)對(duì)照研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013;7(21)：1537-40.

7Wang Y，Bo J，Dai HR，etal.CIK cells from recurrent or refractory AML patients can be efficiently expanded in vitro and used for reduction of leukemic blasts in vivo〔J〕.Exp Hematol，2013;41(3)：241-52.

8李敏，鄧海峰，陸明洋，等.CIK治療前后腫瘤患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞變化研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(6)：1051-3.

9Persidis A.Cancer multidrug resistance〔J〕.Nat Biotechnol，1999;17(1)：94-5.

〔2015-07-10修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號(hào)〕R737.31

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1306-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.012

通訊作者：劉林林(1970-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤的免疫治療、化學(xué)治療和放射治療的研究。

1吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

第一作者：賈雪麗(1990-)，女，在讀碩士，主要從事惡性腫瘤的免疫治療、化療和放射治療的研究。