顧方樂，盧丹，汪萍，孔祥，張艷馨，黃夏曼，呂芳，劉凱峰，張曉梅*

(1.蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，揚(yáng)州　225001；2. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州　225001)

?

孕激素對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞RL95-2中骨橋蛋白表達(dá)的影響

顧方樂1，盧丹1，汪萍1，孔祥1，張艷馨1，黃夏曼2，呂芳1，劉凱峰1，張曉梅1*

(1.蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，揚(yáng)州225001；2. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225001)

【摘要】目的探討孕酮對人子宮內(nèi)膜細(xì)胞RL95-2骨橋蛋白(OPN)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其臨床意義。方法利用免疫熒光方法觀察OPN在RL95-2細(xì)胞的表達(dá)定位。將不同濃度的孕酮(1×10-9mol/L、1×10-7mol/L、1×10-5mol/L)處理RL95-2細(xì)胞24 h，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和免疫印跡檢測(Western blot)技術(shù)檢測各組OPN mRNA和蛋白的表達(dá)水平，以不加孕酮的實(shí)驗(yàn)組為空白對照組。結(jié)果OPN定位表達(dá)于RL95-2細(xì)胞膜表面；與對照組相比，高濃度孕酮(1×10-5mol/L)組的OPN mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，低濃度孕酮(1×10-9mol/L)組則顯著抑制OPN mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論在一定濃度范圍內(nèi)，孕酮可雙向調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜表面骨橋蛋白的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】孕酮；骨橋蛋白；子宮內(nèi)膜；著床

(JReprodMed2016，25(3)：253-257)

胚胎著床是母體和胎兒間的交互對話，卵巢甾體激素是其中的主要調(diào)控因素。正常月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜只有排卵后6～8 d(“著床窗”期)內(nèi)允許胚胎著床，此時雌孕激素達(dá)到峰值，子宮內(nèi)膜以最大程度接受胚胎種植，這種狀態(tài)稱為“子宮內(nèi)膜容受性”[1]。著床期雌孕激素上升均能提高子宮內(nèi)膜腺體的分泌活性，但孕激素的作用占主導(dǎo)地位，孕激素使血管周圍基質(zhì)細(xì)胞增大并分泌多種生物學(xué)分子以促進(jìn)胚胎粘附。這其中最有代表性的是骨橋蛋白(OPN)及其受體整合素[2]，OPN通過自身的RGD(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸三肽)序列與整合素結(jié)合促進(jìn)胚泡粘附并傳遞胞外信號[3]，研究表明OPN在“著床窗”期呈高度的時空特異性[4-5]，說明OPN的表達(dá)可能受孕激素調(diào)控。本研究通過孕激素對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞(RL95-2)中OPN表達(dá)的影響，探討OPN在胚胎著床中的作用。

材料與方法

一、細(xì)胞系及主要試劑

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL95-2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。DMEM/F12培養(yǎng)基(Corning，美國)，無酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、活性炭過濾胎牛血清、0.25%胰酶[含乙二胺四乙酸(EDTA)](GIBCO，美國)，孕酮、胰島素干粉、牛血清蛋白(BSA)和DABCO封片劑(Sigma，美國)，小鼠抗人OPN抗體、山羊抗小鼠IgG-FITC抗體(Santa Cruz，美國)，4%多聚甲醛(Solarbio，中國)，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒(Takala，日本)，Trizol試劑(Invitrogen，美國)，蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒及KCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海康成)，免疫印跡(Western blot)用小鼠抗人OPN抗體(Abcam，美國)，兔抗小鼠二抗(上海康成)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及激素處理：RL95-2細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% 熱失活的胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、青鏈霉素以及5 μg/ml胰島素)培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境均為37℃、5% CO2的潮濕環(huán)境，每2～3 d傳代1次。

將處于對數(shù)生長期的RL95-2細(xì)胞消化，并以5×105/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板，次日更換無酚紅DMEM/F12和10% 活性炭過濾胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的孕酮并依次分組為1×10-9mol/L組、1×10-7mol/L組、1×10-5mol/L組，以不加孕酮的實(shí)驗(yàn)組為空白對照組，處理24 h后收集細(xì)胞用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡檢測(Western blot)實(shí)驗(yàn)。

2.免疫熒光檢測法：將未處理的RL95-2細(xì)胞消化接種于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板，待細(xì)胞60%～70% 匯合后進(jìn)行以下染色步驟：用4% 多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，用0.1% Triton×100透化20 min，PBS清洗3次，用1% BSA封閉1.5 h，加入小鼠抗人OPN一抗(稀釋倍數(shù) 1∶100) 4℃孵化過夜。用加入0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)沖洗3次，每次5 min，隨后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶100)，37℃下遮光孵化2 h。PBST沖洗3次，每次5 min，加入二脒基苯基吲哚DAPI(0.5 μg/ml)染核10 min，用三乙烯二胺(DABCO)進(jìn)行封片，在蔡司LSM 710共聚焦顯微鏡下觀察染色效果，用蔡司ZEN成像軟件獲得圖像。

3. 實(shí)時熒光定量PCR：(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)：按照Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，分光光度計測算各組總RNA濃度。取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入5×PimeScript RT Master Mix 4 μl，焦炭酸二乙酯 (DEPC)水補(bǔ)足總反應(yīng)體系為20 μl，置于 37℃ 15 min，再置于 85℃ 5 s，快速冷卻至4℃；(2)引物設(shè)計：本實(shí)驗(yàn)所用引物是根據(jù)Genbank的人目的基因cDNA (NM00582.2)設(shè)計，由上海英駿生物有限公司合成，序列分別為：OPN(149 bp)：5’-TGGCCGAGGTGATAGTGTG-3’，5’-CGGGGATGGCCTTGCATG-3’。內(nèi)參β-actin(234 bp)：5’-AAGACCTGTACGCCAACACAGT-3’，5’-AGA AGCATTTGCGGTGGACGAT-3’；(3)實(shí)時熒光定量PCR：取RT的cDNA 2 μl，加入2×SYBR Premix Ex Taq 10 μl，50×ROX Reference Dye 及上下游引物各0.4 μl，DEPC水補(bǔ)足總反應(yīng)體系為20 μl。置于ABI 7500 PCR儀中，95℃預(yù)變性30 min后執(zhí)行40個循環(huán)：95℃變性5 s，60℃退火34 s，溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s；(4)數(shù)據(jù)分析：SDS系統(tǒng)分析得到各組CT值后，利用2-ΔΔCT公式測定各組細(xì)胞OPN的mRNA相對表達(dá)量，ΔΔCT=(實(shí)驗(yàn)組CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參CT值)-(對照組CT值-對照組內(nèi)參CT值)，對照組ΔΔCT為 0，因此 2-ΔΔCT值為 1。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組2-ΔΔCT值<1，該藥物視為有抑制作用，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組2-ΔΔCT值>1，該藥物視為有促進(jìn)作用。

4. Western blot：各組RL95-2細(xì)胞用胰酶消化后計數(shù)置于微量離心管(EP管)中，按107個細(xì)胞中加入1 ml抽提試劑的比例，加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑(1 ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl苯甲基磺酰氟和5 μl磷酸酶混合液)，冰浴下?lián)u動15 min進(jìn)行裂解。將裂解液在4℃中12 000g離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度并用酶標(biāo)儀測定濃度，將等質(zhì)量蛋白(50 μg)加入上樣緩沖液后煮沸，進(jìn)行SDS-PAGE，80 V電泳 1.5 h。轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，200 mA 轉(zhuǎn)移2 h。用5% 脫脂奶粉室溫封閉4 h，將膜置于小鼠抗人OPN抗體(稀釋濃度1∶1 000)4℃過夜，用TBST清洗3次，將膜置于辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠二抗(稀釋濃度1∶5 000)孵育1 h，TBST清洗3次，用KCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行定影顯影，X光膠片曝光。用Image J分析軟件檢測圖片中各特異條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、OPN在RL95-2細(xì)胞的定位表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示：OPN為綠色熒光標(biāo)記，細(xì)胞核由DAPI染為藍(lán)色，可以看到在未處理的RL95-2細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面均有綠色熒光，但在細(xì)胞膜表面表達(dá)較明顯(圖1)，推測OPN定位表達(dá)于RL95-2細(xì)胞膜表面，可能為胚胎粘附做準(zhǔn)備。

DAPI：DAPI染色；OPN：OPN蛋白檢測；Merge：合并圖圖1　OPN在RL95-2細(xì)胞中的表達(dá)定位 免疫熒光法 ×200

二、不同濃度的孕酮對OPN mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，高濃度孕酮(1×10-5mol/L)組的OPN mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，低濃度孕酮(1×10-9mol/L)組則顯著抑制OPN mRNA的表達(dá)(P<0.05)(圖2)。

10-5：孕酮濃度為1×10-5 mol/L組，10-7：孕酮濃度為1×10-7 mol/L組，10-9：孕酮濃度為1×10-9 mol/L組與對照組比較，*P<0.05圖2　各組RL95-2細(xì)胞中OPN mRNA的表達(dá)比較

三、不同濃度的孕酮對OPN蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，OPN蛋白的表達(dá)隨著孕酮作用濃度的升高而增加。高濃度孕酮(10-5mol/L)OPN 蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，低濃度孕酮(10-9mol/L)OPN蛋白的表達(dá)水平則顯著低于對照組(P<0.05)(圖3)，與OPN mRNA表達(dá)的變化趨勢是一致的。

A：Western blotting條帶；B：各組灰度值分析10-5：孕酮濃度為1×10-5 mol/L組，10-7：孕酮濃度為1×10-7 mol/L組，10-9：孕酮濃度為1×10-9 mol/L組，N：對照組。與對照組相比，*P<0.05圖3　各組RL95-2細(xì)胞中OPN蛋白的表達(dá)

討論

從世界第一例試管嬰兒的出生到現(xiàn)在，輔助生殖技術(shù)已經(jīng)解救了越來越多的不孕癥夫婦，然而目前IVF的臨床妊娠率仍然處于較低的水平，如何提高胚胎著床成功率是關(guān)鍵。成功的胚胎著床需要胚胎與子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育，相較胚胎質(zhì)量而言，子宮內(nèi)膜的影響因素更復(fù)雜，因而更難以調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)在“著床窗”期子宮內(nèi)膜在卵巢甾體激素的靶向作用下會分泌大量有粘附活性的細(xì)胞因子[6-7]。

OPN及其受體整合素是子宮內(nèi)膜分泌的粘附分子。OPN是一種具有多種生物學(xué)活性的分泌型磷酸蛋白，在體內(nèi)多個分泌性組織中廣泛地分布。在“著床窗”期，胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞及子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞均合成整合素和OPN并分泌至細(xì)胞表面，兩者特異性結(jié)合形成識別復(fù)合物，OPN成為連接子宮和胚胎的橋接分子，促進(jìn)子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)層細(xì)胞的粘附，這就是著名的胚泡植入“三明治”模型理論[8]。本研究所選用的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞RL95-2具有強(qiáng)粘附性，并對卵巢甾體激素等的作用敏感[9]，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN定位表達(dá)于RL95-2細(xì)胞的膜表面，說明OPN在子宮內(nèi)膜的表面分布，為胚胎的起始粘附做好準(zhǔn)備，進(jìn)一步驗(yàn)證了“三明治”理論。

卵巢甾體激素中，雌激素主要以正反饋?zhàn)饔谜T發(fā)LH峰促進(jìn)排卵，并調(diào)節(jié)局部子宮防御機(jī)制使囊胚植入不受母體的免疫攻擊[10]。而孕激素主要作用于子宮內(nèi)膜，一方面使其呈分泌期形態(tài)為植入的胚胎提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面分泌期子宮內(nèi)膜具有更大的生物學(xué)活性利于容納胚胎[11-12]。為證實(shí)OPN基因的表達(dá)是否受孕激素調(diào)節(jié)，本研究用不同濃度的孕激素處理RL95-2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，孕激素對RL95-2細(xì)胞OPN mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)濃度依賴性：孕激素濃度升高可顯著上調(diào)OPN的表達(dá)，由此推測“著床窗”期孕激素升高可上調(diào)子宮內(nèi)膜OPN的表達(dá)，有利于胚胎著床。也有研究發(fā)現(xiàn)胚胎著床需要黃體支持[13-14]；孕激素濃度降低明顯下調(diào)OPN的表達(dá)，由此可解釋臨床上胚胎著床時缺乏孕酮往往會導(dǎo)致著床失敗的原因[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)孕激素對RL95-2細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用，不僅為臨床上IVF術(shù)后黃體支持提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為不孕癥患者克服胚胎著床障礙提供了理論基礎(chǔ)。孕激素調(diào)控下的OPN參與著床的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。深入研究這些著床相關(guān)因素對于提高助孕技術(shù)，開拓避孕的新途徑有著長遠(yuǎn)的意義。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Lessey BA. Assessment of endometrial receptivity [J]. Fertil Steril，2011，96：522-529.

[2]顧方樂，張曉梅. 整合素αvβ3、骨橋蛋白對子宮內(nèi)膜容受性的影響[J]. 中國生育健康雜志，2013，24：174-176.

[3]Johnson GA，Burghardt RC，Bazer FW，et al. Osteopontin：roles in implantation and placentation [J]. Biol Reprod，2003，69：1458-1471.

[4]Apparao KB，Murray MJ，F(xiàn)ritz MA，et al. Osteopontin and its receptor alphavbeta(3) integrin are coexpressed in the human endometrium during the menstrual cycle but regulated differentially [J]. J Clin Endocrinol Metab，2001，86：4991-5000.

[5]Liu N，Zhou C，Chen Y，et al. The involvement of osteopontin and β3 integrin in implantation and endometrial receptivity in an early mouse pregnancy model[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170：171-176.

[6]高明霞，薛石龍，張學(xué)紅，等. 子宮內(nèi)膜容受性的評估與干預(yù)[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：13-19.

[7]劉雪梅，朱桂金，鐘剛. 雌、孕激素及肝素結(jié)合生長因子對Ishikawa細(xì)胞HOXA10基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2007，16：35-39.

[8]Lessey BA，Castelbaum AJ. Integrins and implantation in the human[J]. Rev Endocr Metab Disord，2002，3：107-117.

[9]Nannan NJ，Paiva P，Dimitriadis E，et al. Models for study of human embryo implantation：choice of cell lines? [J]. Biol Reprod，2010；82：235-245.

[10]石玉華，陳子江. 雌激素的生理意義[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34：530-534.

[11]Wetendorf M，DeMayo FJ. Progesterone receptor signaling in the initiation of pregnancy and preservation of a healthy uterus [J].Int J Dev Biol，2014，58：95-106.

[12]Large MJ，DeMayo FJ. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling[J].Mol Cell Endocrinol，2012，358：155-165.

[13]Labarta E，Martínez-Conejero JA，Alamá P，et al. Endometrial receptivity is affected in women with high circulating progesterone levels at the end of the follicular phase：a functional genomics analysis[J].Hum Reprod，2011，26：1813-1825.

[14]Zhang XM，Lv F，Wang P，et al. Estrogen supplementation to progesterone as luteal phase support in patients undergoing in vitro fertilization：systematic review and meta-analysis[J].Medicine(Baltimore)，2015，94：e459.

[15]Young SL. Oestrogen and progesterone action on endometrium：a translational approach to understanding endometrial receptivity[J/OL]. Reprod Biomed Online，2013，27：497-505.

[16]Lessey BA，Young SL. Homeostasis imbalance in the endometrium of women with implantation defects：the role of estrogen and progesterone [J]. Semin Reprod Med，2014，32：365-375.

[編輯：郭永]

Effect of progesterone on expression of osteopontin in endometrial adenocarcinoma cell line RL95-2

GUFang-le1，LUDan1，WANGPing1，KONGXiang1，ZhangYan-xin1，HUANGXia-man2，LYUFang1，LIUKai-feng1，ZHANGXiao-mei1*

1.NorthernJiangsuPeople’sHospital，Jiangsu，Yangzhou225001；

2.ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity，Jiangsu，Yangzhou225001

【Abstract】

Objective： To investigate the effect of progesterone on the expression of osteopontin (OPN) gene in endometrial adenocarcinoma cells cell line RL95-2.

Methods： The localization of OPN of RL95-2 cells was detected by immunofluorescence staining. RL95-2 cells were incubated with different concentrations of progesterone(1×10-9mol/L、1×10-7mol/L、1×10-5mol/L)for 24 hours，while the control group were treated with medium only. The expression of OPN gene was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting respectively.

Results： OPN was obviously expressed on the membrane surface of RL95-2 cells. High concentration of progesterone(1×10-5mol/L)significantly up-regulated the OPN expression(P<0.05)，and low concentration of progesterone(1×10-9mol/L)significantly down-regulated OPN expression in RL95-2 cells(P<0.05).

Conclusions： Progesterone in a certain concentration rage can dual-directionally regulate the OPN expression on the membrane surface of endomentium.

Key words：Progesterone；Osteopontin；Endomentium；Implantation

【作者簡介】顧方樂，女，江蘇漣水人，碩士生，婦產(chǎn)科學(xué)專業(yè).(*通訊作者，Email：zhangxiaomeiyz@163.com)

【基金項(xiàng)目】國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81100421)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2014-WSW-080)；揚(yáng)州市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(YZ2014050)

【收稿日期】2015-08-05；【修回日期】2015-11-03

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.011