謝琦，吳敏儀，楊逸銘，張鼎旋，雷正賢，張靜，許進(jìn)，鐘維德

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擴(kuò)散加權(quán)MRI活體評(píng)價(jià)外源野生型P53逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU人類結(jié)腸癌效果

謝琦1*，吳敏儀1，楊逸銘1，張鼎旋1，雷正賢1，張靜4，許進(jìn)2，鐘維德3

[摘要]目的 探索擴(kuò)散加權(quán)MRI (DWI)活體評(píng)價(jià)rAd/p53逆轉(zhuǎn)耐5-FU結(jié)腸癌SW480/5-FU對(duì)5-FU耐藥性效果的可能性。材料與方法 100只結(jié)腸癌SW480/5-FU荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，對(duì)照組、5-FU組、rAd/p53組、rAd/p53+5-FU組。各組在治療后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分別隨機(jī)取5只荷瘤鼠行DWI檢查，隨后處死荷瘤鼠，切下腫瘤檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡(TUNNEL法)。結(jié)果 rAd/p53組與rAd/p53+5-FU組在觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤ADC值均較對(duì)照組增加，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；rAd/p53組與rAd/p53+5-FU組在觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤凋亡較對(duì)照組增加；rAd/p53+5-FU組在觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤腫瘤凋亡和ADC值較rAd/p53組高。ADC值與腫瘤凋亡呈正相關(guān)。結(jié)論 ADC值能活體評(píng)價(jià)外源野生型p53逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU耐藥性早期療效。

[關(guān)鍵詞]基因，p53；結(jié)腸腫瘤；氟尿嘧啶；彌散磁共振成像；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2015A03 0313732)

作者單位：

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院 廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣州 511457

2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院病理科，廣州 510180

3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院臨床分子醫(yī)學(xué)及分子診斷實(shí)驗(yàn)室，廣州 510180

4.中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科，廣州 510180

謝琦，E-mail：xieqi8@yeah.net

接受日期：2015-11-07

謝琦, 吳敏儀, 楊逸銘, 等.擴(kuò)散加權(quán)MRI活體評(píng)價(jià)外源野生型P53逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU人類結(jié)腸癌效果.磁共振成像, 2016, 7(1): 56–61.

In vivo detection of the reversal effects using rAd/p53 to human colon cancer in mice with diffusion-weighted magnetic resonance imaging

XIE Qi1*, WU Min-yi1, YANG Yi-ming1, ZHANG Ding-xuan1, LEI Zheng-xian1, ZHANG Jing4, XU Jin2, ZHONG Wei-de3

1Medical Imaging Department, Nan Sha Center Hospital, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511457, China.

2Department of Pathology, Guangzhou Municipal First People's Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

3Clinical molecular medicine and molecular diagnostics laboratories, Guangzhou Municipal First People's Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, China

4Department of Pathology, Sun yat-Sen University Cancer center, Guangzhou 510080, China

*Correspondence to: Xie Q, E-mail: xieqi8@yeah.net

Received 1 Oct 2015, Accepted 7 Nov 2015

ACKNOWLEDGMENTS Natural Science Foundation of Guangdong Province (No.2015A030313732).

Abstract Objective: To investigate the potential of diffusion-weighted magnetic resonance imaging (DWI) to detect the reversal effects of rAd/p53 for 5-FU resistance of human colon cancer in vivo.Materials and Methods: One hundred nude mice with human colon cancer SW480/5-Fu (5-Fu resistance) were randomly assigned into four groups: control group, 5-FU group, rAd/p53 group, rAd/p53+5-FU.At 24 h, 48 h, 72 h, 120 h and 168 h after treatment, 5 mice were selected randomly from each group and given DWI examinations.Then these mouse models were sacrificed with an overdose of anesthetic.Their tumors were removed and detected apoptosis (TUNNEL).Results: The ADC values at the edge area of the tumor in rAd/p53 and rAd/p53+5-FU groups were significantly higher than that of the control groups at the observed time points (P＜0.05).The area ratios of tumor cell apoptosis in the rAd/p53+5-FU and rAd/p53 group were larger than that of control groups at the observed time point.The area ratios of tumor cell apoptosis and the ADC values in the rAd/p53+5-FU group were larger than that of rAd/p53 group at the observed time point.The ADC values of tumors were positively correlated with the area ratios of tumor cell apoptosis.Conclusions: The ADC value can evaluate the reversal effects of drug resistance with rAd/p53 in early stage of therapy in vivo.

Key words Genes, p53; Colonic neoplasms; Fluorouracil; Diffusion magnetic resonance imaging; Animal experimentation

本課題組在前期研究的結(jié)果中證實(shí)，擴(kuò)散加權(quán)MRI (diffusion-weighted MRI，DWI)活體檢測(cè)rAd/p53治療人類結(jié)腸癌荷瘤裸鼠24 h即可以出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變[1]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，rAd/p53+5-FU治療非耐藥SW480結(jié)腸癌荷瘤裸鼠，可以加速腫瘤細(xì)胞的凋亡及提高p53蛋白的表達(dá)[2-3]。筆者進(jìn)一步運(yùn)用DWI觀察rAd/p53逆轉(zhuǎn)耐5-FU人類結(jié)腸癌耐藥性效果早期改變，探索D W I活體評(píng)價(jià)rAd/p53逆轉(zhuǎn)耐5-FU人類結(jié)腸癌效果早期療效的標(biāo)記物。

1　 材料與方法

1.1對(duì)5-Fu耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞株制作

人類結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系(購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清(杭州四季青公司)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基)、37oC，5%CO2孵箱中。采用逐步提高培養(yǎng)基中5-氟尿嘧啶 (5-FU)濃度間歇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥，5-FU藥物濃度從0.5 μg/ml開始，1～2 d換液一次，待細(xì)胞重新從此濃度生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)再次提高藥物濃度(依次為1 μg/ml、1.5 μg/ml、2 μg/ml、2.5 μg/ml、3 μg/ml、3.5 μg/ml、4 μg/ml、4.5 μg/ml、6 μg/ml)，連續(xù)培養(yǎng)5個(gè)月，獲得能夠在6 μg/ml 5-FU濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)的人類結(jié)腸癌SW480耐藥細(xì)胞株(SW480/5-FU)。

1.2動(dòng)物模型制作

本項(xiàng)目經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查通過(guò)。選取鼠齡4周的健康BALB/c 裸小鼠(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重約16～18 g，前期研究所采用組織塊移植方法[1-3]制作耐5-FU結(jié)腸癌SW480/5-FU荷瘤鼠，100只。

荷瘤鼠腫瘤1.5 cm左右，活體測(cè)量腫瘤體積(V=π/6×長(zhǎng)×寬×高)，將上述荷瘤鼠分隨機(jī)成三組：對(duì)照組(給予生理鹽水)、rAd/p53組(深圳賽百諾生物科技公司)、5-FU組、rAd/p53+5-FU組。rAd/p53用量為1×107VP (virus particle)/mm3腫瘤，5-FU(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)用量為0.5～0.9 cm的腫瘤用25 mg，1.0～1.4 cm的腫瘤為50 mg，1.5 cm以上的腫瘤為75 mg[2-3]。給藥途徑為直接瘤內(nèi)注射。

1.3MRI及實(shí)驗(yàn)室檢查

1.3.1MRI檢查

治療后24 h、48 h、72 h、120 h、168 h每組隨機(jī)抽5只荷瘤鼠，水合氯醛麻醉(4.5%水合氯醛2 ml/100 ml，腹腔注射)，采用SIEMENS MAGNETOM Verio-3.0 T超導(dǎo)型磁共振成像系統(tǒng)及配套腕關(guān)節(jié)正交線圈進(jìn)行檢查。

(1) T2WI快速自旋回波(TSE)：TR 4500 ms，TE 82 ms，層厚2 mm，間隔0，F(xiàn)OV 128mm× 128mm，NAS為4，SENSE加速因子為2，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸面、冠狀面、矢狀面成像，成像時(shí)間3 min 45 s (圖1A)。(2) DWI：采用單次激發(fā)平面回波成像序列(single shot echo planar imaging, EPI)，橫軸面成像，TR 5900 ms, TE 100 ms，按各向同性施加擴(kuò)散敏感梯度場(chǎng)，取b值=800 mm2/s，成像時(shí)間9 min 26 s。FOV 220 mm×220 mm，NAS為3，層厚2 mm，采集矩陣220×220，重建矩陣308×308。采集的起止范圍與T2WI軸面絕對(duì)一致(圖1B)。

1.3.2標(biāo)本檢測(cè)

BALB/c裸小鼠于磁共振檢查完畢后，腹腔注射5倍于麻醉量的10%水合氯醛處死，在無(wú)菌狀態(tài)下掏出腫瘤，以最大徑線處一分為二，放入緩沖福爾馬林溶液中，以便進(jìn)行石蠟包埋切片及細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.3.3數(shù)據(jù)收集

DWI數(shù)據(jù)的采集使用西門子磁共振成像儀工作站輸出ADC圖，在腫瘤最大橫切面利用感興趣區(qū)(ROI)自動(dòng)測(cè)量并計(jì)算出ADC值，ROI放置在腫瘤邊緣非壞死區(qū)最大區(qū)域，ROI面積為8～75 mm2(圖1B)。

HE染色與TUNNEL結(jié)果分析：病理切片由2名病理科醫(yī)師分別按同一標(biāo)準(zhǔn)在顯微鏡下閱片分析，取2名醫(yī)師所采集的均值為病理的檢測(cè)最終結(jié)果數(shù)值。TUNNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色，在×100視野下觀察并估算切片內(nèi)TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞與形態(tài)為死亡細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞面積的百分比為腫瘤凋亡范圍。

圖1　 荷瘤鼠腫瘤T2WI成像(A)與ADC圖(B)Fig.1 The T2 weighted image (A) and ADC map (B) of tumor in nude mice.

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用?x-± s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布兩組之間比較用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　 結(jié)果

2.1DWI檢測(cè)結(jié)果

5-FU組24 h、48 h時(shí)ADC值較對(duì)照組減少，72 h、120 h、168 h時(shí)ADC值較對(duì)照組增加，兩者之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.223、0.151、0.135、0.748、0.369；表1)。

r Ad/p53組及r Ad/p53+5-FU腫瘤邊緣(24 h、48 h、72 h、120 h、168 h) ADC值均較對(duì)照組增大，兩者之間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；表1)。

表1　不同組各時(shí)間點(diǎn)腫瘤ADC定量結(jié)果(?-x± s，× 10–4mm2/s)Tab.1 ADC values of different groups at observed time point (?x-± s, × 10–4mm2/s)

表 2 不同治療組腫瘤凋亡(TUNNEL)情況比較(x-± s)Tab.2 The area ratios of tumor cell apoptosis of different groups at observed time point (-x± s)

對(duì)照組與各治療組不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠腫瘤組織均見(jiàn)癌細(xì)胞凋亡(表2)。5-FU組癌細(xì)胞凋亡范圍較對(duì)照組有增大，兩者差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義(P值分別為0.069、0.160、0.174、0.127、0.083)；rAd/p53與rAd/p53+5-FU治療組癌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；rAd/p53+5-FU組癌細(xì)胞凋亡較rAd/p53組增加，24 h兩者差別無(wú)顯著性(P=0.055)，在48 h、72 h、120 h、168 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3ADC值與腫瘤凋亡的相關(guān)性分析

5-FU治療組，腫瘤ADC值與腫瘤細(xì)胞凋亡范圍無(wú)相關(guān)性(r=0.090，P=0.805)；rAd/p53治療組，腫瘤ADC值與腫瘤細(xì)胞凋亡范圍呈正相關(guān)性(r=0.427，P=0.001)；rAd/p53+5-FU治療組腫瘤ADC值與腫瘤細(xì)胞凋亡范圍呈顯著正相關(guān)(r=0.571，P=0.000)。

3　 討論

大多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時(shí)已是中晚期，治療主要以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為主的化療性姑息治療，但腫瘤細(xì)胞本身或在化療過(guò)程中出現(xiàn)對(duì)5-FU的耐受使患者無(wú)進(jìn)展生存期僅8.7～12.3個(gè)月[4]，也成為結(jié)腸癌臨床化療的主要問(wèn)題。有研究結(jié)果提示腫瘤抑制基因p53的突變或丟失可促進(jìn)耐藥性產(chǎn)生[5-8]。

rAd/p53抗癌機(jī)制之一就是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性或增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[9-12]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，腺病毒介導(dǎo)的野生型p53可逆轉(zhuǎn)對(duì)5-FU耐藥的人類結(jié)腸癌LoVo/5-FU的MDR[ 9 ]與對(duì)阿霉素耐藥的人類乳腺癌MCF-7/ADM的MDR[10]，或增加胃癌對(duì)奧沙利鉑的敏感性[11]、膀胱癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性[12]。臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，放療與化療無(wú)效的結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移瘤的患者經(jīng)肝動(dòng)脈插管注入腺病毒包裝的p53基因，隨后給予5-FU或放射治療，可見(jiàn)腫瘤縮小，并生存期較無(wú)反應(yīng)的患者明顯提高[13]。本課題組前期研究首次顯示rAd/p53與5-FU對(duì)結(jié)腸癌荷瘤鼠有相互協(xié)同抗癌作用[2-3]。本研究針對(duì)耐藥結(jié)腸癌進(jìn)行研究，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)突變型p53 的耐5-FU人類結(jié)腸癌SW480/5-FU裸鼠耐藥模型，對(duì)模型分別給予5-FU、rAd/p53、rAd/p53+5-FU治療，與對(duì)照組對(duì)比，5-FU組腫瘤細(xì)胞凋亡范圍無(wú)明顯增加，rAd/p53組凋亡范圍有意義增大，rAd/p53+5-FU凋亡范圍進(jìn)一步增加，提示rAd/p53本身對(duì)耐藥腫瘤具有促進(jìn)凋亡作用，同時(shí)與5-FU有協(xié)同抗癌作用，進(jìn)一步說(shuō)明具有逆轉(zhuǎn)SW480/5-FU對(duì)5-FU的耐藥性。

而如何及時(shí)、準(zhǔn)確的判斷結(jié)腸癌的耐藥性及p53干預(yù)后耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果，以決定是否行單獨(dú)化療或聯(lián)合p53基因治療或其它治療以及治療的時(shí)間間隔等，尋找一種較客觀、準(zhǔn)確、能在活體狀態(tài)下及時(shí)檢測(cè)腫瘤耐藥性及評(píng)價(jià)p53逆轉(zhuǎn)耐藥性效果的影像技術(shù)十分必要，對(duì)指導(dǎo)臨床治療中晚期結(jié)腸癌、提高結(jié)腸癌療效有重要意義。

DWI通過(guò)影像量化反應(yīng)活體組織內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，顯示活體組織在分子和細(xì)胞水平上的生物學(xué)過(guò)程，已作為內(nèi)源性分子影像技術(shù)用于活體結(jié)構(gòu)改變前功能變化的探索[14-18]，以及治療前腫瘤對(duì)治療的敏感性預(yù)測(cè)研究[17-19]。擴(kuò)散成像信號(hào)改變的水分子運(yùn)動(dòng)源自三個(gè)腔隙：細(xì)胞內(nèi)間隙擴(kuò)散、細(xì)胞外間隙擴(kuò)散、血管內(nèi)間隙擴(kuò)散，表觀擴(kuò)散系數(shù)值(apparent diffusion coefficient，ADC)反映組織擴(kuò)散特征的量化值，與細(xì)胞內(nèi)外成分的比例有關(guān)，并隨著組織或細(xì)胞密度的增加而降低[14-16]；而細(xì)胞密度可以作為腫瘤侵襲性的指征，隨著細(xì)胞密度的增加，腫瘤的轉(zhuǎn)移性增加；除了細(xì)胞膜，細(xì)胞骨架、有機(jī)質(zhì)、基質(zhì)纖維和可溶性大分子對(duì)腫瘤的擴(kuò)散受限起到了作用[2, 15-16]。腫瘤治療常引起腫瘤血管與細(xì)胞發(fā)生變化，導(dǎo)致三腔隙水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)改變，成為DWI定量評(píng)估腫瘤治療效果的分子基礎(chǔ)[14]。因此，DWI提供了與組織生物物理特性、細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)的獨(dú)特信息，如細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)、微結(jié)構(gòu)和微循環(huán)。

文獻(xiàn)報(bào)道，DWI對(duì)晚期結(jié)腸癌輔助放化療或抗腫瘤血管生成的治療效果的預(yù)測(cè)研究結(jié)果有沖突[17, 19-26]。大多數(shù)的研究結(jié)果顯示對(duì)治療有較好療效或有效的腫瘤組織治療前ADC值低于療效差或無(wú)效的腫瘤組織[17, 19-20, 22-24],也有研究者的結(jié)果提示治療有效與治療無(wú)效的腫瘤組織治療前的ADC值沒(méi)有差別[21, 25-26]。對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者行一線化療研究結(jié)果提示治療前腫瘤組織的ADC值偏低者的無(wú)進(jìn)展生存期與總生存期較短[19]。盡管如此，在對(duì)晚期結(jié)腸癌放化療、抗血管生成治療的研究均提示DWI在治療早期即可顯示ADC值升高，對(duì)療效的評(píng)價(jià)早于解剖影像的評(píng)價(jià)[1, 17-24]。

本研究基于DWI觀察腫瘤對(duì)放化療的敏感性預(yù)測(cè)的啟發(fā)，將DWI用于結(jié)腸癌耐藥性逆轉(zhuǎn)評(píng)價(jià)。對(duì)耐5-FU的結(jié)腸癌SW480/5-FU荷瘤鼠，單獨(dú)5-FU治療，腫瘤的凋亡范圍和ADC值與對(duì)照組對(duì)比無(wú)顯著性變化；經(jīng)rAd/p53或rAd/p53+5-FU治療后24 h，腫瘤的凋亡范圍和ADC值出現(xiàn)有意義增高，并聯(lián)合治療組凋亡范圍和ADC值較單獨(dú)rAd/p53組增加值高，治療后ADC值與腫瘤凋亡范圍呈正相關(guān)。野生型p53蛋白通過(guò)阻止腫瘤G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，通過(guò)多種途徑引起p53觸發(fā)凋亡機(jī)制清除腫瘤細(xì)胞[5-8]。本研究的結(jié)果提示外源野生型p53增加了5-FU引起的癌細(xì)胞凋亡，可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對(duì)5-FU的耐藥性，使5-FU對(duì)耐藥癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌效果。筆者推測(cè)耐藥腫瘤組織經(jīng)rAd/p53或rAd/p53+5-FU干預(yù)后，促發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞之間連接消亡，與周圍的細(xì)胞分開，細(xì)胞濃縮，腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器碎裂、溶解，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞膜完整性受到破壞，使水分子擴(kuò)散能力增強(qiáng)，ADC值升高。

綜上所述，rAd/p53可逆轉(zhuǎn)耐藥結(jié)腸癌組織對(duì)5-FU的耐藥性，DWI通過(guò)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)腫瘤內(nèi)水分子擴(kuò)散的改變，通過(guò)量化的實(shí)時(shí)ADC值，反映活體腫瘤內(nèi)病理生理改變信息，可提供p53逆轉(zhuǎn)耐藥結(jié)腸癌早期療效活體評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床研究的指導(dǎo)作用有待進(jìn)一步探討。

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DOI:10.12015/issn.1674-8034.2016.01.011

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R445.2；R735.3+5

收稿日期：2015-10-01

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