曹翠玲,張玖玲,楊向娜,邵　陽

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100;2 深圳華大基因研究院,廣東深圳 518083)

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金銀花根系VAM真菌侵染過程觀察

曹翠玲1,張玖玲2,楊向娜1,邵陽1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100;2 深圳華大基因研究院,廣東深圳 518083)

摘要:在金銀花生長季節(jié),從西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)藥用植物園采集金銀花根系及根際土壤,采用形態(tài)學(xué)方法觀察研究了VAM真菌侵染其根系的過程,并對其孢子進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)分類。結(jié)果表明:(1)VAM真菌侵染金銀花根系時,先形成附著胞,然后入侵到皮層細(xì)胞,在根內(nèi)形成線性菌絲、圈狀菌絲;菌絲末端產(chǎn)生泡囊;在較粗的菌絲上產(chǎn)生叢枝狀菌絲,而且VAM胞內(nèi)菌絲主干可以穿越相鄰的2個皮層細(xì)胞,在皮層中連續(xù)形成叢枝;VAM菌絲形成叢枝時,首先是胞內(nèi)菌絲上膨大產(chǎn)生乳狀突起,而后在乳狀突起上產(chǎn)生較粗的叢枝柄,最后在這些叢枝柄上產(chǎn)生極細(xì)的叢枝狀菌絲形成成熟的叢枝結(jié)構(gòu)。(2)VAM真菌菌絲在金銀花皮層細(xì)胞中,有伸展?fàn)顟B(tài)、菌絲圈及叢枝狀態(tài),所以金銀花與VAM真菌形成的菌根是混合型菌根。(3)金銀花根際土壤中至少存在3種類型的VAM真菌孢子,因此認(rèn)為金銀花至少可與3種VAM真菌共生。(4)金銀花種植地土壤有效磷含量(6.6 mg/kg)顯著高于對照空地土壤有效磷含量(3.5 mg/kg);金銀花生長旺盛季(4月下旬到5月中旬)VAM真菌對其根系的侵染率高達(dá)81%。

關(guān)鍵詞:金銀花根系;VAM真菌;侵染過程

金銀花(Lonicerajaponica)是著名清熱解毒的良藥。金銀花性甘寒,功能清熱解毒、消炎退腫,對細(xì)菌性痢疾和各種化膿性疾病都有效。已生產(chǎn)的金銀花制劑有“銀翹解毒片”、“銀黃片”、“銀黃注射液”等。“金銀花露”是用蒸餾法提取的金銀花芳香性揮發(fā)油及水溶性溜出物,為清火解毒的良品,可治小兒胎毒、瘡癤、發(fā)熱口喝等癥;暑季用以代茶,能治溫?zé)狃鸲?、血痢等。莖藤稱“忍冬藤”,也供藥用[1];同時,由于金銀花耐蔭,且是灌木狀,還可以用來做綠化矮墻,亦可以利用其纏繞能力制作花廊、花架、花欄、花柱以及纏繞假山石等等[2]。

早在1900年,人們就在土壤中發(fā)現(xiàn)了與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)關(guān)系最為密切、分布最廣的一種內(nèi)生菌根真菌即叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)。AMF是廣泛分布于土壤中的一類微生物,由于其菌絲體能侵入到宿主植物組織細(xì)胞內(nèi)部,在根部皮層細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生“泡囊”和“叢枝”兩大典型結(jié)構(gòu),所以俗稱為泡囊-叢枝菌根(vesicular-arbuscular mycorrhiza,VAM)[3]。VAM真菌是一類能夠與大多數(shù)植物形成共生關(guān)系的真菌,與許多植物共生形成菌根后,顯著促進(jìn)植物對磷元素的吸收,進(jìn)而促進(jìn)植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量[4],如VAM真菌侵染馬鈴薯根系后,馬鈴薯產(chǎn)量顯著提高[5];黃花蒿接種摩西球囊霉后,N、P、K的吸收明顯增加,凈光合速率提高,植株莖、小枝和葉中的青蒿素含量明顯提高[6]。因此與VAM真菌共生的植物礦質(zhì)營養(yǎng)、生理活性得以改變,提高了植物的生理代謝活性[7-10]。

國外一直都十分重視對AM真菌種質(zhì)資源、分布特征、生物多樣性及其生態(tài)功能的研究[11-15]。中國近年來在該領(lǐng)域也開展了大量工作[16-17]。了解VAM真菌與植物互生關(guān)系,對開發(fā)利用VAM真菌有及其重要的意義。目前有學(xué)者研究了丹參、牡丹[18-19]等植物根圍的VAM真菌多樣性,但關(guān)于金銀花根圍VAM多樣性及VAM真菌侵染其根系過程的觀察研究未見報道。筆者調(diào)查了在自然條件下,VAM真菌侵染金銀花根系的過程,以期了解并豐富中國藥用植物金銀花與VAM真菌互生關(guān)系的理論知識,豐富VAM生活史的內(nèi)容，以期為利用菌根真菌提高藥用植物生長提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1樣地概況

1.2樣品采集

2012年3月至5月陸續(xù)取樣。每次取樣均隨機(jī)選定10年生金銀花3株。取土?xí)r先除去金銀花根圍3 cm厚的表層土,而后挖取10 cm×10 cm×10 cm的土樣(其中有金銀花的根系),迅速裝入自封袋后拿回實驗室。然后選直徑0.5 mm左右的根系,將附在根上的土壤輕輕抖落于無菌自封袋中,用自來水清洗根系,而后用FAA固定根段24 h,用于觀察VAM真菌侵染狀況;將剩下的根系和附近根際土在無菌自封袋中輕輕抖動約1 min,風(fēng)干并保存,用于測定土壤有效磷含量和pH值?；虿扇「H土壤,用于提取孢子。

1.3測定項目及方法

1.3.1菌根侵染過程觀察不同時間取回的根系,均采用Christopher[20]的方法。先將植物細(xì)根剪下，在FAA中固定過夜;然后在5% KOH溶液中加熱(略低于沸點)120 min,洗去堿液后用0.1 mol·L-1鹽酸軟化1 min,倒去酸液后放進(jìn)0.1%甲烯藍(lán)溶液中染色90 min。染色完成后以甘油為浮載劑將細(xì)根做成臨時裝片。用Olympus BX53顯微鏡觀察,并用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行觀察拍照。

1.3.2菌根侵染率的調(diào)查和計算方法細(xì)根染色、分色后在顯微鏡下觀察VAM真菌侵染情況。按0%、10%、20%、30%……100%的侵染數(shù)量計算出每條根段的侵染率[17],并記錄。依下列公式計算該樣品的菌根侵染率:

侵染率={Σ(0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+AA+100%×根段數(shù))}÷觀察總根段數(shù)

1.3.3金銀花根際土壤中孢子外形觀察采用濕篩傾析法分離VAM真菌孢子,在Nikon SMZ25體視鏡下觀察記錄孢子形態(tài)。

1.3.4土壤有效磷含量測定用鉬銻抗法[21]測定。

2結(jié)果與分析

2.1VAM真菌對土壤有效磷的影響

通過重復(fù)測定10 cm深度金銀花采樣地土壤和同等條件下空地土壤,結(jié)果顯示,金銀花采樣地土壤有效磷含量為6.6 mg/kg;同等條件下空地土壤有效磷含量為3.5 mg/kg。二者之間的差異顯著(P<0.05)。這可能是由于金銀花根圍每年都有大量的落葉等有機(jī)物累積而造成的。但不論是金銀花采樣地還是空白地,土壤均屬缺磷土壤。

2.2金銀花根系VAM真菌侵染分析

VAM是植物根系和VAM真菌在適宜生態(tài)條件下的共生體,因此侵染率大小與土壤溫度以及植物的生長狀態(tài)有密切關(guān)系。圖1顯示,在金銀花生長季節(jié),隨著時間的延續(xù),菌根侵染率逐漸升高。從3月28日到4月26日,間隔29 d,菌根侵染率增加了5%;從4月26日到5月15日,間隔19 d,侵染率增長了28%。統(tǒng)計分析表明,3月28日與4月26日之間的浸染率差異不顯著,而它們與5月份的浸染率差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。這說明,VAM真菌侵染金銀花根系的最佳時間是4月下旬到5月中旬。這可能是由于5月份土壤溫度逐漸升高、根系生理代謝旺盛、根系分泌物增加,比較有利于VAM真菌生長。

2.3VAM真菌對金銀花根系的侵染及其菌絲發(fā)育過程觀察

2.3.1附著胞的形成附著胞是VAM真菌與植物建立共生體系過程中形態(tài)上發(fā)生的特異性變化,標(biāo)志著該真菌成功識別到一個潛在的宿主植物上[22]。本試驗觀察到VAM真菌侵染金銀花根時,孢子萌發(fā)形成的根外菌絲在金銀花根表形成一個扁平的膨大結(jié)構(gòu),即附著胞,其上可見菌絲(圖版Ⅰ,1)。附著胞發(fā)生的部位即為VAM侵入宿主的侵入點。一般來說附著胞出現(xiàn)4～5 h后,宿主根表皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核會向侵入點處移動,并引導(dǎo)形成侵入結(jié)構(gòu)(prepenetration apparatus,PPA)[23]。 附著胞形成后,VAM真菌在根皮層側(cè)形成纖細(xì)的針狀感染型菌絲,進(jìn)而VAM真菌就在植物根的皮層細(xì)胞內(nèi)伸展繁衍。

圖1　不同月份的菌根侵染率

2.3.2根內(nèi)菌絲VAM真菌菌絲在宿主根內(nèi)有不同的形態(tài),其菌根名稱亦不同,菌絲在細(xì)胞內(nèi)形成叢枝結(jié)構(gòu)的,菌根結(jié)構(gòu)類型為疆南星型;菌絲在細(xì)胞內(nèi)呈菌絲圈的,其菌根結(jié)構(gòu)類型為重樓型(簡稱P-型);細(xì)胞內(nèi)存在大量胞間菌絲和孢內(nèi)圈狀菌絲的,菌根結(jié)構(gòu)類型被稱為中間型(簡稱I-型)[24-25]。本試驗結(jié)果顯示,在金銀花根部,VAM真菌菌絲能形成大量的叢枝結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ,2～6),同時菌絲又以菌絲圈(圖版Ⅰ,7、8)形式存在。同時結(jié)果還表明,金銀花根內(nèi)菌絲還有大量的胞間菌絲(圖版Ⅰ,7)。但金銀花根內(nèi)大量的P型菌絲主要分布在近中柱的皮層處,此處細(xì)胞大且排列疏松,菌絲侵入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)卷曲、緊貼細(xì)胞壁生長一圈至兩圈后,在原來進(jìn)入細(xì)胞的部位再伸出細(xì)胞而進(jìn)入相鄰細(xì)胞,再形成菌絲圈;還可以看到,形成菌絲圈的菌絲上有不規(guī)則膨大,似乎呈串珠狀(圖版Ⅰ,8)。由此看來,金銀花與VAM真菌形成的菌根是混合型菌根。Cavagnaroetal[26]認(rèn)為VAM結(jié)構(gòu)類型主要由宿主植物本身的特性(根系皮層細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間隙的大小)所決定。

2.3.3叢枝結(jié)構(gòu)叢枝是菌絲在皮層細(xì)胞內(nèi)形成的雜亂無章的菌絲結(jié)構(gòu)即吸器結(jié)構(gòu)。1905年Gallaud因這種結(jié)構(gòu)很像細(xì)小的樹枝將其命名為Arbuscular(來自于拉丁文arbusculum,意思是灌叢或者小喬木)[27]。叢枝的功能主要是吸收和釋放養(yǎng)分。因此叢枝是真菌與宿主植物細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)。本試驗結(jié)果顯示,與金銀花根系共生的VAM真菌在皮層細(xì)胞內(nèi)能形成大量的叢枝結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ,2 ),而且叢枝似乎是菌絲生長到一定時間后,在多個皮層細(xì)胞中同時發(fā)生(圖版Ⅰ,3)。因此推測,VAM真菌侵入金銀花根皮層細(xì)胞后,可能是隨著根延伸生長,菌絲一邊在多個皮層細(xì)胞延伸生長,一邊在較粗的菌絲上形成叢枝。當(dāng)VAM菌絲形成叢枝時,首先在胞內(nèi)菌絲上膨大產(chǎn)生一個乳突狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ,4),在其上再產(chǎn)生較粗的叢枝柄,然后在這些叢枝柄上產(chǎn)生極細(xì)的叢枝菌絲形成成熟的叢枝結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ,5、6)。整體來看,金銀花根皮層細(xì)胞內(nèi),VAM真菌形成叢枝,分枝似鹿角,主干菌絲(直徑5～10 μm)上再產(chǎn)生2～3級的分枝,有些二級分枝膨大,呈乳突狀,其直徑超過了菌絲,然后在其上產(chǎn)生向周圍伸出的細(xì)小叢枝結(jié)構(gòu)(直徑小于1 μm；圖版Ⅰ,4～6)。同時作者還觀察到,金銀花根中的VAM胞內(nèi)菌絲主干可以穿越相鄰的2個皮層細(xì)胞,連續(xù)形成叢枝(圖版Ⅰ,5)。

2.3.4泡囊泡囊是菌絲膨大而形成的結(jié)構(gòu)。在叢枝出現(xiàn)后泡囊即開始生長,但在叢枝普遍退化后泡囊仍繼續(xù)生長發(fā)育直至成熟。泡囊中有脂肪和細(xì)胞質(zhì),所以被認(rèn)為是重要的營養(yǎng)物質(zhì)儲藏器官[28]。本試驗觀察結(jié)果顯示,在金銀花根中,有正在發(fā)育的泡囊(圖版Ⅰ,9),發(fā)育成熟的泡囊充滿了所在的皮層細(xì)胞(圖版Ⅰ,10),其形狀相似于所在的皮層細(xì)胞形狀,多是單獨存在(圖版Ⅰ,11)。

本試驗觀察到,泡囊似乎可聚集發(fā)生(圖版Ⅰ,12),似乎是菌絲在不同的皮層細(xì)胞中可以連續(xù)膨大而形成囊泡。金銀花根中的泡囊,還可以出泡形成泡囊(圖版Ⅰ,13),這與Abbott[29]的結(jié)果相似。

2.4金銀花根際的VA真菌的孢子形態(tài)

孢子是VAM的繁殖體。通常具有多層細(xì)胞壁,內(nèi)部含有細(xì)胞質(zhì)以及多個核。有研究表明,在陜西農(nóng)田中,主要分布的有Glomusmosseae、G.aggregatum、G.caledonium、G.geosporum、G.versiforme、G.dimorpicum和G.constrictum[30]這幾個種。其中Glomusmosseae和G.aggregatum出現(xiàn)機(jī)率較大。本研究觀察結(jié)果顯示,在金銀花根際存在3種顏色的VAM真菌孢子(圖版Ⅰ,14、15):黑色、棕色和黃色孢子。其中黑色孢子直徑為190～250 μm,棕色直徑是286 μm,黃色孢子的直徑是210～267 μm。這個結(jié)果說明,在金銀花根際,存在著VAM真菌多樣性,也就是說,金銀花同時可以和多種VAM真菌共生,形成VAM。參照Schenck等[31]的“VAM真菌鑒定手冊”以及劉潤進(jìn)等[17]的分類標(biāo)準(zhǔn),初步判定這幾種VAM真菌可能都屬于球囊霉目。到底是哪種,尚需做進(jìn)一步的分子鑒定。

3討論

在自然狀況下,一種宿主植物根際土壤中通常生活著幾種VAM真菌[32-33],它們與植物形成了共生關(guān)系,植物為VAM真菌提供了一個安全的生態(tài)位,并為其提供生長繁殖所需的碳水化合物,而真菌則幫助植物增強(qiáng)對磷、鋅、銅等礦質(zhì)元素和水分的吸收,并增強(qiáng)植物的抗逆性,競爭能力等。Mosse認(rèn)為任何一種VAM真菌均可以感染任意一種植物形成VAM菌根,即VAM真菌與宿主植物之間無專一性[34]。但李濤等[35]研究結(jié)果顯示,不同宿主植物根際能容納VAM真菌的種群數(shù)以及各種群數(shù)量明顯不同,即不同植物根際土壤中VAM真菌種群的組成和數(shù)量是有區(qū)別的,也就是說雖然VAM真菌對宿主植物不存在專一性,但宿主植物對VAM真菌卻有選擇。本試驗支持后者的觀點。

侵染率是表征根系菌根化程度高低的常用指標(biāo)。劉永俊等[36]指出,AMF總侵染率的最高和最低值分別出現(xiàn)在檸條的生長初期(4月)和末期(10月);AMF侵染率和土壤孢子密度具有顯著的季節(jié)性變化,宿主植物根系內(nèi)的AMF群落組成也有季節(jié)性差異[36]。這是因為AMF的季節(jié)性主要受宿主植物物候關(guān)系的影響[37-39]。本試驗樣地地處關(guān)中平原,實驗進(jìn)行時間也是3月到5月,在此期間,關(guān)中地區(qū)溫度逐漸升高、光照時間逐漸延長、降水量逐漸上升,恰是金銀花旺盛生長階段,因此在3～5月份,VAM真菌侵染率呈升高趨勢。這充分說明VAM真菌侵染植物根系,除與植物類型有關(guān)外,還與外界環(huán)境條件密切相關(guān):溫度越低,光照強(qiáng)度越弱、植物生長越緩慢,VAM真菌生長發(fā)育就越遲緩。在自然界中,VAM真菌可能與寄主植物的生長發(fā)育進(jìn)程是同步的[40]。

但是關(guān)于金銀花中VAM真菌孢子詳細(xì)發(fā)育過程,作者還未觀察到。本研究擬進(jìn)一步觀察研究孢子發(fā)育的詳細(xì)過程，以期豐富金銀花VA真菌的理論知識庫。

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圖版說明:

圖版 Ⅰ1.根表面的附著胞;2.皮層細(xì)胞VAM真菌叢枝結(jié)構(gòu)及其分布;3.皮層細(xì)胞VAM真菌叢枝同時發(fā)生;4.皮層細(xì)胞菌絲上的乳突狀結(jié)構(gòu)(紅色箭頭);5.VAM真菌粗大菌絲(箭頭)穿過相鄰細(xì)胞后再形成叢枝;6.皮層細(xì)胞中VAM成熟的叢枝結(jié)構(gòu);7.皮層細(xì)胞中線型(紅色箭頭)菌絲和圈狀菌絲(黃色箭頭);8.放大的圈狀菌絲;9.正在發(fā)育的泡囊;10.皮層細(xì)胞中分布的泡囊;11.泡囊形狀相似于所在皮層細(xì)胞形狀;12.連續(xù)發(fā)生多個泡囊;13.泡囊分裂;14.3種顏色的成熟孢子;15.具有胞連絲的孢子皮層細(xì)胞VAM真菌叢枝結(jié)構(gòu)放大圖(箭頭)。

Explanation of plate:

Plate ⅠFig.1.The prepenetration apparatus on theroot surface of honeysuckle;Fig.2.The distribution and structure of Arbuscules in the cortical cells;Fig.3.Took place of Arbuscules in the cortical cell at the same time;Fig.4.The mastoid structure of hyphae in the cortex cells(red arrow);Fig.5.The bulky hyphae(arrow) through the adjacent cell walls and then formed arbuscular arbscule stucture;Fig.6.The amplificaition of the structure of a arbuscule fromed in the cortex cells;Fig.7.The linear hyphae(red arrow) and hyphal coil (yellow arrow) in the cortex cells;Fig.8.Amplification of hyphal coil;Fig.9.Developing vesicle;Fig.10.The distribution of the vesicle in cortex;Fig.11.The vesicle shape was similar to the shape of the cortical cell,where the vesicle was located;Fig.12.Occurrence of vesicles consecutively;Fig.13.The split of vesicles;Fig.14.Three colors of mature spores;Fig.15.Yellow spore with hyphae.

(編輯:潘新社)

Investigation of the Mycorrhiza Forming in Honeysuckle Infected by Vesicular Arbuscular Mycorrhizal(VAM)

CAO Cuiling1,ZHANG Jiuling2,YANG Xiangna1,SHAO Yang1

(1 College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2 Shenzhen Huada Gene Research Institute of Guangdong,Shenzhen,Guangdong 518083,China)

Abstract:In this paper,authors investigated the forming process of VAM in the root of honeysuckle.Results showed that:(1)when honeysuckle’s root was infected by VAM fungi,appressorium appeared firstly in the root epidermis,and then hyphae invaded cortical cells.There were down with linear and looped hyphae to form finaly in the cortical cells.Vesicle appeared at the end of the hyphae;In the thick hyphae,very tiny and dense mycelium appeared.It looked like a crown that was the arbuscular.some coarser hyphae could pass through two neighboring cortical cells and formed arbuscular continuously.When VAM hyphae formed arbuscular,VAM hyphae inflated and formed a emulsion bumps and then grow out of a short and thick stalk hyphae,then wiched broom.(2)There were three VAM hyphae morphological types in honeysuckle cortex cells:the stretching,hyphal coils and arbscule;honeysuckle with VAM mycorrhiza should belong to mixed mycorrhizal.(3)There were at least three types of VAM fungi spores in the honeysuckler’s rhizosphere,so honeysuckle formed a symbiotic relationship with at least three kinds of VAM fungi.(4)Available phosphorus content of the soil planting honeysuckle was 6.6 mg/kg that was significantly higher than that of the no plant soil’s (3.5 mg/kg);Impregnation rate of the VAM was 81% in the vigorous growth season (late April to mid-May).

Key words:Honeysuckle rootsystem;VAM fungi;infection process

中圖分類號:Q944.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:曹翠玲(1960-),女,博士,教授,主要從事植物養(yǎng)分生理的研究。E-mail:cuilingcao@nwsuaf.edu.com

基金項目:陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃(2013K01-38)

收稿日期:2015-12-31;修改稿收到日期:2016-02-29

文章編號:1000-4025(2016)03-0479-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0479