楊　梅,周頌東,何興金,彭　昶

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610064)

?

中國假百合屬親緣關(guān)系及假百合遺傳多樣性的ISSR分析

楊梅,周頌東*,何興金,彭昶

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610064)

摘要:利用7條ISSR引物對(duì)中國假百合屬植物24個(gè)居群255個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明:(1)UPGMA聚類結(jié)果顯示,假百合(Notholirion bulbuliferum)、鐘花假百合(N.campanulatum)與大葉假百合(N.macrophyllum)分別聚為三支,在分子水平上出現(xiàn)了明顯的分化,揭示三者是獨(dú)立物種。(2)N.bulbuliferum×N.campanulatum與鐘花假百合聚為一支,這可能與其母系遺傳和極強(qiáng)的無性繁殖體系有關(guān),但兩者間基因流(Nm=0.216 0)很低,假百合與N.bulbuliferum×N.campanulatum的基因流(Nm=0.144 9)也極低,說明N.bulbuliferum×N.campanulatum正在分化。(3)假百合種下各居群間按照地理結(jié)構(gòu)可明顯分為4支,經(jīng)Mantel檢測(cè)表明存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)(r=0.410,P=0.01)。(4)AMOVA分析顯示，假百合居群間遺傳變異為77.12%(P<0.01),而居群內(nèi)為22.88%(P<0.01),同樣表明居群間遺傳分化大于居群內(nèi)。研究結(jié)果揭示了橫斷山區(qū)假百合屬植物的親緣關(guān)系,從分子水平上為其鑒定提供了依據(jù);并從遺傳結(jié)構(gòu)上為藥用植物假百合的可持續(xù)利用和開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:遺傳多樣性;ISSR;假百合;鐘花假百合;大葉假百合

假百合屬是百合科百合族較為原始的類群[1-2],屬下共有5種,其中大葉假百合(Notholirionmacrophyllum)、鐘花假百合(N.campanulatum)和假百合(N.bulbuliferum)等3種分布于中國西部橫斷山區(qū)及東喜馬拉雅[3]。因其鱗莖由基生葉增厚套迭而成,外面具黑褐色的膜質(zhì)鱗莖皮,與百合屬的特征相似而被作為百合屬的一個(gè)亞屬;而后又有學(xué)者將其歸為貝母屬的一個(gè)亞屬[4]。假百合屬植物具卵形的小鱗莖,成熟后外殼稍硬,內(nèi)有數(shù)片白色肉質(zhì)的鱗片;柱頭明顯3裂,這些特征明顯區(qū)別于百合族的其它屬,Boissier將其提升為獨(dú)立的屬并得到大多數(shù)學(xué)者的支持,同時(shí)發(fā)表了大葉假百合[5-7]。Conton與Stearn又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了鐘花假百合和假百合[6-7]。而有研究顯示,假百合與鐘花假百合之間存在雜交,即假百合×鐘花假百合(N.bulbuliferum×N.campanulatum)。據(jù)文獻(xiàn)記載以及野外觀察發(fā)現(xiàn)這四者在未開花時(shí)很難辨認(rèn)(圖1),假百合為常用中藥材,對(duì)其鑒定的準(zhǔn)確與否直接關(guān)系到藥材質(zhì)量,所以從分子水平上對(duì)其屬下種間關(guān)系探討迫在眉睫。假百合屬植物生長在2 700～4 000 m高海拔地帶,且大多生長在人跡罕至的深山中,極少受到關(guān)注,更未從分子水平上對(duì)這四者進(jìn)行過親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究。

ISSR被稱作簡單重復(fù)區(qū)間多態(tài)性擴(kuò)增,或微衛(wèi)星PCR,方法是用17～22個(gè)重復(fù)堿基序列作為引物擴(kuò)增出重復(fù)序列間的片段[8],因其操作步驟簡單易行[9-10],應(yīng)用范圍十分廣泛。在百合族中運(yùn)用ISSR技術(shù)探討了青島百合[11]的遺傳多樣性,提出了麝香百合的分子鑒定依據(jù)[12]；趙麗華等[13]采用ISSR技術(shù)對(duì)中國百合屬親緣關(guān)系進(jìn)行了研究；沈呈娟等[14]對(duì)近緣類群寶興百合與匍莖百合進(jìn)行了親緣關(guān)系與遺傳多樣性的研究。本實(shí)驗(yàn)通過ISSR分子標(biāo)記對(duì)中國假百合屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,為藥用植物假百合的分子鑒定提供了參考,并對(duì)假百合進(jìn)行了居群水平上的遺傳多樣性研究，為假百合可持續(xù)利用和保護(hù)提供了理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)包括24個(gè)居群,共計(jì)255個(gè)個(gè)體,其中假百合、鐘花假百合、假百合×鐘花假百合、大葉假百合的居群數(shù)分別為18、2、3、1個(gè)。按居群采樣時(shí),每個(gè)個(gè)體至少間隔50 m以上,將采集的新鮮葉片置入硅膠干燥備用。并將野外采集的個(gè)體引種栽培于實(shí)驗(yàn)室,憑證標(biāo)本存放于四川大學(xué)標(biāo)本館(SZ)。采樣基本覆蓋中國假百合屬的分布范圍(表1,圖2)。

1.2ISSR標(biāo)記分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)材料新鮮嫩葉采用植物基因組DNA試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)提取總DNA。DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),利用紫外分光光度計(jì)確定其濃度,將樣品稀釋至25 ng/μL,最后將樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ｋS機(jī)從每個(gè)居群中抽取2個(gè)樣本作為引物篩選的模板,根據(jù)哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的引物序列,從中篩選出穩(wěn)定性好,重復(fù)性強(qiáng)且條帶清晰的7條引物作為本次實(shí)驗(yàn)的引物(Invitrogne公司合成),引物編號(hào)及序列見表2。

從每個(gè)居群選取3個(gè)個(gè)體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),最終確定PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL:包含25 ng模板DNA,1.0 UTaqDNA聚合酶,1×PCR緩沖液,1 μmol/L ISSR引物,0.5 mmol/L dNTPs,1.5 mmol/L MgCL2。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,51.5 ℃～55.5 ℃(視引物Tm

居群編號(hào)同表1

物種Species居群編號(hào)Populationcode采集地Location海拔Altitude/m經(jīng)度Longitude(E)緯度Latitude(N)樣本數(shù)Number假百合N.bulbuliferumQL陜西秦嶺Qinling,Shaanxi2800107°42'33°57'10SP四川松潘Songpan,Sichuan3342103°50'32°43'10LX四川理縣Lixian,Sichuan3541102°39'31°50'10HS四川黑水Heishui,Sichuan3229102°37'32°03'10JC四川金川Jinchuan,Sichuan3600102°05'31°10'10KD四川康定Kangding,Sichuan3701101°47'30°06'10YJ四川雅江Yajiang,Sichuan3638100°53'29°58'10XC四川鄉(xiāng)城Xiangcheng,Sichuan365099°59'28°57'10ML四川木里Muli,Sichuan3414101°09'28°09'10XiC四川西昌Xichang,Sichuan3300102°22'27°35'10MN四川冕寧Mianning,Sichuan3300102°15'28°53'10MG四川美姑Meigu,Sichuan3200102°54'28°36'10YX四川越西Yuexi,Sichuan3600101°95'27°52'10LQ云南祿勸Luquan,Yunnan3987102°50'26°05'10DY云南大姚Dayao,Yunnan3357101°19'25°43'10DQ云南德欽Deqin,Yunnan334099°23'28°50'11MK西藏芒康Mangkang,Xizang381798°40'29°13'12LZ西藏林芝Linzhi,Xizang343694°43'29°41'10假百合×鐘花假百合N.bulbuliferum×N.campanulatumDL云南大理Dali,Yunnan3933100°09'25°01'12ZD云南中甸Zhongdian,Yunnan334099°48'27°33'13LJ云南麗江Lijiang,Yunnan3627101°10'26°10'12鐘花假百合N.campanulatumTC云南騰沖Tengchong,Yunnan350098°17'25°32'10GS云南貢山Gongshan,Yunnan334198°17'28°23'10大葉假百合N.macrophyllumJL西藏吉隆Jilong,Xizang345085°30'28°30'15

值而定)退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。以DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,用含有Gold view的1.5%瓊脂糖凝膠于120 V恒壓電泳45 min。最后在凝膠成像系統(tǒng)儀上進(jìn)行拍照并保存(Bio-Rad Gel Doc XR+imaging system),用于后續(xù)分析。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

ISSR作為顯性分子標(biāo)記視每一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)為一個(gè)等位基因。以DL2000進(jìn)行參照對(duì)比,在同一相對(duì)遷移位置出現(xiàn)清晰條帶的計(jì)為1,沒有或模糊的條帶記為0,將條帶數(shù)據(jù)信息構(gòu)建成0和1的原始數(shù)據(jù)矩陣。使用POPGENE 1.32軟件分析遺傳變異的各項(xiàng)參數(shù):如多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、Nei’s基因多樣度指數(shù)(H)、Nei’s遺傳距離(D)和遺傳一致度(Hi)、平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)(Na)、平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因(Ne)、Shan-non多樣性信息指數(shù)(I)、居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、居群內(nèi)基因多樣度(Hs)、總的基因多樣度(Ht)、基因流(Nm)等[15-16]。然后利用NTSYS-pc 2.10構(gòu)建樹狀聚類圖以及計(jì)算遺傳相似性系數(shù)(Gs)[17],對(duì)假百合屬下種間關(guān)系進(jìn)行分析。遺傳變異在居群內(nèi)與居群間的分布情況通過AMOVA 1.55軟件計(jì)算得出[18]。最后使用GenAlEX 6.5對(duì)遺傳距離與地理距離之間相關(guān)性進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)[19]。

表2　ISSR引物序列和最佳退火溫度

注:Y=C/T;R=A/G。

Note:Y=C/T;R=A/G.

2結(jié)果與分析

2.1ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的初步檢測(cè)

圖3為引物UBC815對(duì)假百合屬植物進(jìn)行擴(kuò)增后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果。其它引物都達(dá)到很好的擴(kuò)增效果,表明選定的反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序效果較好,擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下一步的數(shù)據(jù)分析。

2.2假百合屬ISSR結(jié)果分析

從20條ISSR引物中篩選出了能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好的7條引物,對(duì)假百合屬全部供試材料進(jìn)行PCR分析,共計(jì)擴(kuò)增出91個(gè)清晰可重復(fù)的多態(tài)性有效位點(diǎn),其中多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)91個(gè)(PPB=100%)。7條引物擴(kuò)增后的DNA條帶數(shù)目從10到16,平均條帶數(shù)目為13,變異長度從200 bp到2 000 bp。POPGENE1.32分析顯示(表3):在這7條引物中平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因(Ne)從 1.044 0到1.248 2,平均值為1.146 3。平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)(Na)從1.155 8到1.441 6,平均值為1.259 0。Nei’s基因多樣度指數(shù)(H)從0.051 8到0.262 0,平均值為0.146 8。以及Shannon多樣性信息指數(shù)(I)從0.082 3到0.317 7,平均值為0.164 0。

1～3.假百合,康定居群;4～9.大葉假百合;10～13.鐘花假百合;14～23.假百合×鐘花假百合;24～28.假百合,秦嶺居群

物種Species居群編號(hào)PopulationcodeNaNeHIPPB/%假百合N.bulbuliferumQL1.4026±0.49361.223±0.35410.1295±0.18680.2964±0.267740.26SP1.3117±0.46621.1185±0.24320.1069±0.13800.1943±0.207931.17LX1.2078±0.40841.1003±0.24070.2620±0.13700.1662±0.203720.78HS1.1948±0.39861.1001±0.24130.1615±0.13780.1646±0.204719.48JC1.1948±0.39861.1003±0.24270.2617±0.13730.1646±0.204519.48KD1.4416±0.49981.2347±0.33320.1422±0.18250.3177±0.266344.16YJ1.1948±0.39861.1283±0.29730.1728±0.15890.1677±0.229219.48XC1.2727±0.44831.1492±0.29940.1084±0.16340.1843±0.238227.27ML1.2597±0.44141.1704±0.31480.1995±0.17540.1773±0.255725.97XiC1.3636±0.48421.2347±0.35150.1365±0.19290.2024±0.279736.36MN1.1558±0.36511.1021±0.27790.2564±0.14650.0830±0.208815.58MG1.1558±0.36521.0889±0.24400.0518±0.13550.0830±0.196915.58YX1.1948±0.39861.1359±0.30680.1756±0.16580.1601±0.236919.48LQ1.1948±0.39871.1017±0.24770.1821±0.13830.1655±0.205019.48DY1.1688±0.37711.1019±0.25880.0595±0.14330.1591±0.208916.88DQ1.3247±0.47131.1812±0.31660.1074±0.17550.2012±0.255432.47MK1.2597±0.44141.1223±0.27250.1737±0.14890.1773±0.217825.97LZ1.1558±0.36511.0440±0.13920.1308±0.08720.0823±0.137515.58平均值A(chǔ)verage1.24751.13550.15660.174824.75物種水平Atspecieslevel1.6576±0.12661.4378±0.22560.4582±0.05280.3432±0.125593.9假百合×鐘花假百合N.bulbuliferum×N.campanulatumDL1.3506±0.48031.2482±0.38460.1378±0.20230.2013±0.288235.06ZD1.2597±0.44141.1712±0.33470.1957±0.17980.1404±0.256825.97LJ1.2878±0.40841.1365±0.31270.0756±0.16500.1111±0.235220.78鐘花假百合N.campanulatumTC1.2857±0.45481.1828±0.32900.1054±0.18040.1562±0.260728.57GS1.2987±0.46071.1979±0.35040.1113±0.18790.1637±0.268829.87大葉假百合N.macrophyllumJL1.2808±0.41751.1362±0.29990.0783±0.0.16100.1171±0.132922.08

2.3假百合屬聚類分析

通過NTSYSpc-2.10軟件計(jì)算出假百合屬各類群間遺傳相似性系數(shù)(Gs),結(jié)果顯示Gs值范圍從0.535 2到0.813 3,平均值為0.702 2。Gs最低值存在于大葉假百合與假百合之間為0.535 2,這表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn);最高值為鐘花假百合與N.bulbuliferum×N.campanulatum為0.813 3,說明其親緣關(guān)系最近。通過聚類分析也表明,大葉假百合與假百合相距最遠(yuǎn),假百合與鐘花假百合距離最近(圖4)。

2.4假百合遺傳多樣性

利用篩選的7個(gè)ISSR引物(表2)對(duì)假百合進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共計(jì)擴(kuò)增出83個(gè)清晰可重復(fù)的有效位點(diǎn),其中多態(tài)位點(diǎn)有78個(gè)。結(jié)果顯示(表3):在物種水平上,假百合的多態(tài)位百分率(PPB)為93.9%,Ne為(1.437 8±0.225 6),H為(0.458 2±0.052 8),I為(0.343 2±0.125 5)。在居群水平上,各個(gè)居群的PPB范圍從15.58%～44.16%,平均值為24.75%。假設(shè)種群處于Hardy-Weinberg平衡條件下,18個(gè)居群的平均有效等位基因?yàn)?.247 5,平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.135 5,平均Shannon多樣性信息指數(shù)為0.174 8,各項(xiàng)參數(shù)均低于物種水平。

Shannon多樣性指數(shù)表明各居群的遺傳變異由低到高為林芝<冕寧、美姑<大姚<越西<祿勸<雅江<黑水、金川<理縣<芒康、米林<鄉(xiāng)城<松潘<德欽<西昌<秦嶺<康定,與PPB值分析的結(jié)果一致。各居群間遺傳差異較大,其中康定居群(KD)的遺傳多樣性水平最高(PPB=44.16%,Ne=1.234 7,I=0.317 7),林芝居群間的遺傳多樣性水平最低(PPB=15.58%,Ne=1.044 0,I=0.082 3)。

居群編號(hào)同表1

物種Species總基因多樣性Ht居群內(nèi)基因多樣性Hs基因分化系數(shù)Gst基因流Nm假百合N.bulbuliferum0.3020±0.02550.1805±0.0040.74950.1816鐘花假百合N.campnulatum0.0829±0.02720.0771±0.02410.0696.7414假百合×鐘花假百合N.bulbuliferum×N.campnulatum0.1131±0.03410.1675±0.01910.40270.7415物種間Amongspecies0.3325±0.02030.1785±0.00350.76390.1545

2.5假百合遺傳分化與基因流

通過POPGENE 1.32軟件計(jì)算得出假百合18個(gè)居群Ht為0.302 0,Hs為0.180 5,Gst為0.749 5(表4),即74.95%的變異存在于居群之間,25.05%的變異存在于居群內(nèi),結(jié)果顯示居群間的遺傳分化大于居群內(nèi)的分化。居群間的基因流(Nm)為0.181 6,表明居群之間的基因流水平較低。

利用AMOVA 1.55分析表明在總的遺傳變異中,有77.12%(P<0.001)的遺傳變異發(fā)生在居群之間,22.88%(P<0.001)的遺傳變異存在于居群內(nèi),與POPGENE 1.32分析結(jié)果一致,都表明遺傳變異主要存在于居群間。

2.6假百合聚類分析

POPGENE 1.32分析得出假百合18個(gè)居群兩兩間的Nei’s遺傳一致度(Hi),范圍為0.602 6～0.983 1,遺傳距離(D)為0.017 1～0.464 2(表5)。鄉(xiāng)城與雅江居群間遺傳一致度最高(Hi=0.983 1),遺傳距離最近(D=0.017 1),在聚類分析中也聚得最近(圖4);根據(jù)Nei’s遺傳相似性系數(shù),使用NTSYSpc 2.1軟件中的SHANN對(duì)假百合18個(gè)居群進(jìn)行UPGMA聚類分析,18個(gè)居群按照遺傳距離遠(yuǎn)近以及遺傳一致度高低聚為2大支4個(gè)亞支(圖4)。其中雅江和鄉(xiāng)城遺傳一致度最高,遺傳距離最近首先聚在一起,然后與康定和木里聚為Clade Ⅰ;秦嶺、松潘、理縣、黑水和金川遺傳一致度與地理距離也較近優(yōu)先聚為Clade Ⅱ;西昌、冕寧、越西與美姑形成Clade Ⅲ;祿勸、大姚等與其它居群則聚為Clade Ⅳ。2個(gè)大類在0.70閾值處聚在一起。Mantel關(guān)于地理距離和分子遺傳距離的檢測(cè)揭示了假百合居群間的地理距離和遺傳距離存在顯著的相關(guān)性(r=0.410,P=0.01)。

3討論

3.1中國假百合屬遺傳多樣性與種間親緣關(guān)系的探討

生物的遺傳多樣性是珍貴的自然資源,也是人類賴以生存的基礎(chǔ)。物種的遺傳多樣性越高說明其遺傳背景越復(fù)雜,同時(shí)也具有更強(qiáng)的進(jìn)化潛力和對(duì)惡劣環(huán)境的耐受力,且更容易擴(kuò)大生境以及適應(yīng)新的環(huán)境[20]。在本研究中,利用7對(duì)ISSR引物對(duì)中國假百合屬4個(gè)類群進(jìn)行了擴(kuò)增。結(jié)果顯示多態(tài)性百分率(PPB)為100%。通常來說當(dāng)PPB>50%時(shí),被試物種的遺傳多樣性就被視為較高,這表明中國假百合屬植物具有很高的遺傳多樣性。根據(jù)花的形態(tài)以及顏色劃分,中國假百合屬下有3個(gè)種:假百合、鐘花假百合與大葉假百合。而后在云南西北部發(fā)現(xiàn)了N.bulbuliferum×N.campanulatum。因其形態(tài)特征在未開花時(shí)差距甚微,且假百合與鐘花假百合之間存在雜交,從表型上很難區(qū)分。然而假百合為名貴中藥材,所以對(duì)其正確鑒定十分必要,在本研究中遺傳相似性系數(shù)均值(Gs)為0.702 2,表明假百合屬種間具有較高的遺傳相似性;鐘花假百合作為雜交個(gè)體的母本與N.bulbuliferum×N.campanulatum具有較高的遺傳相似性(Gs=0.813 3)且在UPGAMA聚類分析中聚為一支,親緣關(guān)系最近,這可能與鐘花假百合作為雜交個(gè)體的母本且在種子植物中為母系遺傳有關(guān)[21-22];大葉假百合與假百合在聚類分析時(shí)也相距最遠(yuǎn),表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3.2假百合遺傳多樣性及居群間遺傳分化

對(duì)于生物遺傳多樣性的研究是我們探討物種起源以及進(jìn)化的基礎(chǔ),并且可以為人類提供合理的保護(hù)、開發(fā)和利用的理論依據(jù)[23-24]。根據(jù)ISSR分析結(jié)果顯示,假百合物種水平上多態(tài)位百分率(PPB)為93.9%,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.458 2,Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)為0.343 2。這一較高的遺傳多樣性可能是由于假百合的分布從秦嶺延伸到東喜馬拉雅以及生長在平均海拔高度為3 000 m的橫斷山區(qū),而這一地區(qū)具有復(fù)雜的地質(zhì)地貌,高山峽谷縱橫,生活環(huán)境多變。通常,物種具有廣泛的分布就會(huì)展現(xiàn)出較高的遺傳多樣性,這種現(xiàn)象在竹黃菌[25-26]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。一方面,長期的地理隔離導(dǎo)致各居群間適應(yīng)不同的環(huán)境,從而產(chǎn)生較大的遺傳變異;另一方面,也可能是假百合的祖先類群具有多樣性復(fù)雜的基因庫,而后由于青藏高原隆起[27]、橫斷山造山運(yùn)動(dòng)[28-29]以及第四紀(jì)冰期氣候的反復(fù)波動(dòng)導(dǎo)致生境片段化后,而出現(xiàn)如今不同分布地間的遺傳差異。

假百合種下居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.749 5,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Nybom統(tǒng)計(jì)的多種植物ISSR遺傳分化系數(shù)均值(Gst=0.34)[30],同樣也高于寶興百合(Gst=0.642 5)、匍莖百合(Gst=0.563 7)的ISSR遺傳分化系數(shù)[14],這說明假百合居群間存在較高的遺傳分化。而且從NTSYSpc 2.10聚類結(jié)果以及各居群的采樣分布可以看出,Clade Ⅰ與Clade Ⅱ被折多山山脈隔開;Clade Ⅲ與Clade Ⅳ被金沙江流域阻隔;而這兩大支之間存在錦屏山山脈。橫斷山區(qū)復(fù)雜的地貌環(huán)境可能孕育了假百合的異質(zhì)居群結(jié)構(gòu)。而Mantel關(guān)于地理距離與遺傳距離的檢測(cè)存在極顯著的相關(guān)性也恰好說明這一點(diǎn)。雖然假百合有性生殖依靠蟲媒傳份,這會(huì)使得居群間遺傳分化降低,但是假百合生長在橫斷山區(qū),該地區(qū)由高黎貢山、大雪山、錦屏山等7條幾乎平行的山脈和金沙江、瀾滄江與怒江等幾大流域組成,高山峽谷縱橫,大多數(shù)山脈海拔達(dá)到五千多米,形成了天然的地理隔離屏障。這種依靠蟲媒傳粉方式的植物被自然條件阻隔,從而限制了居群間的基因交流,這也是造成假百合居群間遺傳分化值高的又一原因。再者,假百合居群間的基因流(Nm)為0.181 6,當(dāng)Nm<1時(shí),遺傳漂變就可導(dǎo)致居群間明顯的遺傳分化[31],說明遺傳漂變也可能是假百合種下居群間遺傳分化較高的原因。

分布范圍、種子傳播機(jī)制、繁育系統(tǒng)等因素都可影響群體遺傳結(jié)構(gòu),但在異交類型植物中群體間的分化值一般較小[32]。假百合居群間遺傳分化系數(shù)遠(yuǎn)高于遠(yuǎn)交植物,這可能是因?yàn)榧侔俸暇哂袕?fù)雜的兼性生殖繁育系統(tǒng)[33]。在自然生存環(huán)境中,假百合具有大量的小鱗莖。野外取樣過程中觀察發(fā)現(xiàn)小鱗莖繁殖能力極強(qiáng),在脫離母株后,大多數(shù)小鱗莖便形成無性生殖植株,同時(shí)也存在種子實(shí)生苗。假百合在漫長的進(jìn)化歷史中和自然選擇的壓力下,已經(jīng)形成了適應(yīng)環(huán)境要求的有性和無性兩種繁育制度。通過大量觀察發(fā)現(xiàn),假百合聚居現(xiàn)象特別明顯,大多成群分布,遇到有水溝的地方則沿水流方向兩岸分布。據(jù)此推測(cè)依靠小鱗莖的無性繁殖體系是假百合主要的繁殖方式。較強(qiáng)的無性繁殖能力導(dǎo)致了假百合居群內(nèi)遺傳多樣性的降低。

3.3假百合可持續(xù)利用與保護(hù)策略

對(duì)于物種來說,遺傳多樣性水平高低與對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力以及變異和進(jìn)化潛力的強(qiáng)弱是緊密相關(guān)的[34]。豐富的遺傳多樣性是物種具有更高的適應(yīng)和存活能力的基礎(chǔ),從而才能提高物種的進(jìn)化、繁殖以及優(yōu)化遺傳結(jié)構(gòu)的能力[35]?；谀壳暗难芯匡@示,假百合具有很高的遺傳分化。因此,對(duì)集巨大藥用價(jià)值與觀賞價(jià)值于一體的假百合野生資源以及遺傳多樣性的保護(hù)是非常有意義的。假百合野生居群被藥農(nóng)大量采挖,加之近年來道路建設(shè)使得假百合生境破壞以及原生態(tài)旅游業(yè)的大規(guī)模開發(fā),假百合大而艷麗的花朵吸引了游客的采摘。所以,對(duì)現(xiàn)存假百合居群應(yīng)該采取一些有效的保護(hù)措施,比如:對(duì)假百合的生存環(huán)境適度保護(hù),禁止人們過度采挖等;因秦嶺、松潘、康定、西昌、德欽等地具有較高的遺傳多樣性,這些具有豐富的基因多樣性資源的地區(qū)是將來進(jìn)行育種的優(yōu)良種質(zhì)庫的來源，在制定保護(hù)措施和對(duì)其利用時(shí)應(yīng)多加注意。

參考文獻(xiàn):

[1]GAO Y D,HARRISA J,ZHOU S D,etal.Evolutionary events inLilium(includingNomocharis,Liliaceae) are temporally correlated with orogenies of the Q-T plateau and the Hengduan Mountains [J].MolecularPhylogeneticsandEvolution,2013,68(3):443-460.

[2]GAO Y D,ZHOU S D,HE X J.Chromosome diversity and evolution in tribe Lilieae (Liliaceae) with emphasis on Chinese species [J].JournalofPlantResearch,2012,125:55-69.

[3]梁松筠.百合科(狹義)植物的分布區(qū)對(duì)中國植物區(qū)系研究的意義[J].植物分類學(xué)報(bào),1995,33(1):27-51.

LIANG S Y.Chorology of Liliaceae (S.STR) and it’s bearing on the Chinese acta phytotaxonom [J].JournalofSystematicsandEvolution,1995,33(1):27-51.

[4]BAKER J G.Revision of the genera and species ofTulipeae[J].JournaloftheLinneanSociety,1871,14:211-310.

[5]BOISSIER E.Genevaeet Basileae:H.Georg Bibliopolam[J].FloraOrientalis,1884,5:172-203.

[6]COTTON A D,STEARN W T.The genusNotholirion[J].LilyYear-Book,1934,3(19):f.6.

[7]STEARN W T,COTTON A D.A note onParadisea,DiurantheraandNotholirion[J].KewBulletin,1950,5(3):421.

[8]ZIETKIEWICE E,RAFALAKE A,LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.

[9]DOYLE J J.Gene trees and species trees:molecular systematics as an one-character taxonomy[J].SystematicBotany,1992,71:144-163.

[10]TSUMURA Y,OHBA K,STRAUSS S H.Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir(Pseudotsugamenziesii) and sugi (Cryptomeriajapoonica) [J].TheoreticalandAppliedGenetics,1996,9:40-45.

[11]GUO W H,JEONG J,KIM Z,etal.Genetic diversity ofLiliumtsingtauensein China and Korea revealed by ISSR markers and morphological characters[J].BiochemicalSystematicsandEcology,2011,39:352-360.

[12]XI M L,SUN L N,QIU S,etal.Invitromutagenesis and identification of mutants via ISSR in lily (Liliumlongiflorum)[J].PlantCellReports,2012,31:1 043-1 048.

[13]ZHAO L H,LIU H M,CAI G Z ,etal.Assessment of the genetic diversity and genetic relationships ofLiliumin China using ISSR markers[J].BiochemicalSystematicsandEcology,2014,55:184-189.

[14]沈呈娟,周頌東,何興金.寶興百合與匍莖百合遺傳多樣性的ISSR分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(7):1 331-1 338.

SHEN C J,ZHOU S D,HE X J.Genetic diversity ofLiliumduhartreiandLiliumlankongenserevealed by ISSR markers [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2014,34(7):1 331-1 338.

[15]NEI M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals [J].Genetics,1978,89:583-590.

[16]YEH F C,YANG R C,BOTLE T B J,etal.POPGENE:The user friendly shareware for population genetic analysis.(Ver.1.32)[M].Canada:Molecular Biology and Biotechnology Centre,University of Alberta,1997.(program available from:http://www.ualberta.ca/～fyeh/).

[17]ROHLF F J.NTSYS-pc:Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (Ver.2.1) Exeter Software [CP/DK].New York:Setauket,1998.

[18]EXCOFFIER L.AMOVA:Analysis of Molecular Variance (Ver.1.55) [CP/DK].Switzerland:Genetics and Biometry Laboratory,University of Geneva,1995.

[19]PEAKALL R,SMOUSE P E.GenAlEx 6.5:genetic analysis in Excel.Population genetic software for teaching and research——an update[J].Bioinformatics,2012,28:2 537-2 539.

[20]MARTINS M,TENREIRO R,OLIVEIRA M.Genetic relatedness of Portuguese almond cultivars assessed by RAPD and ISSR markers [J].PlantCellReports,2003,22:71-78.

[21]BAUMEL A,AINOUCHE M L,BAYER R J,etal.Molecular phylogeny of hybridizing species from the genusSpartina(Poaceae)[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution,2002,22:303-314.

[22]ZHA H G,MILNE R I,SUN H.Asymmetric hybridization inRhododendronagastum:a hybrid taxon comprising mainly F1s in Yunnan,China [J].AnnalsofBotany,2010,105:89-100.

[23]HELENUR K.High levels of genetic polymorphism in the insular endemic herbJepsoniamalvifolia[J].JournalofHeredity,2001,92:427-432.

[24]LI E X,YI S,QIU Y X,etal.Phylogeography of two east asian species inCroomia(Stemonaceae) inferred from chloroplast DNA and ISSR fingerprinting variation[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution,2008,49:702-714.

[25]FAN Y,ZHONG C G,CHENG J,etal.Genetic differentianton ofShiraiabambusicolapopulatins from east China revealed by RAPD analysis[J].GenomicsandAppliedBiology,2009,28(5):889-895.

[26]QI S S,FAN Y,GONG Z N,etal.Genetic diversity ofShiraiabambusicolafrom East China assessed using ISSR markers [J].BiochemicalSystematicsandEcology,2015,59:239-245.

[27]HARRISON T M,COPELAND P,KIDD W S F,etal.Raising Tibet [J].Science,1992,255:1 663-1 670.

[28]陳富斌.再論橫斷運(yùn)動(dòng)[J].火山地質(zhì)與礦產(chǎn),1996,17:14-21.

CHEN F B.Second discussion on the Hengduan movement [J].VolcanologyandMineralResources,1996,17:14-21.

[29]施雅風(fēng).晚新生代以來青藏高原的隆起與環(huán)境演化[M].廣州:廣州科學(xué)技術(shù)出版社,1998:6-20.

[30]NYBOM H,BARTISH I V.Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants[J].PerspectivesinPlantEcologyEvolutionandSystematics,2000,3(2):93-114.

[31]SLATKIN M.Gene flow in natural population [J].AnnualReviewofEcology,Evolution,andSystematics,1985,16:393-430.

[32]HAMRICK J L,GODT M J W.Plant Population Genetics,Breeding,and Genetic Resources[M].Sinauer:Sunderland,Mass,1990:43-63.

[33]BUSSEL J D.The distribution of random amplified polymorphic(RAPD)diversity amongst population ofIsotomapetraea(Lobeliaceae)[J].MolecularEcology,1999,8:775-789.

[34]HOLSINGER K E.Genetics and Conservation of Rare Plant [M].New York:Oxford University Press,1991:20-55.

[35]FRANKHAM R,BALLOU J D,BRISCOE D A.Introduction to Conversation Genetics[M].Cambridge:Cambridge University Press,2002:10-36.

(編輯:宋亞珍)

Genetic Relationships ofNotholirionand Genetic Diversity ofN.bulbuliferumin China Revealed by ISSR Markers

YANG Mei,ZHOU Songdong*,HE Xingjin,PENG Chang

(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education,College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610064,China)

Abstract:To understand the sibship of Notholirion and the genetic differentiation of N.bulbuliferum,the genetic diversity of 255 individuals from 24 populations was analyzed by using seven inter-simple sequence repeat (ISSR) markers.(1)The results of the UPGMA analysis exhibited significant genetic differentiation between N.bulbuliferum,N.campanulatum,and N.macrophyllum,which indicated that they are separate species.(2)N.bulbuliferum×N.campanulatum clustered together with N.campanulatum,which may be a result from the matrilineal inheritance and strong asexual reproduction capacity;its low gene flow (Nm=0.216 0) implied that N.bulbuliferum×N.campanulatum may be undergoing differentiation.(3)The Mantel test showed a substantial significant correlation between genetic and geographic distances in N.bulbuliferum (r=0.410,P=0.01),and clustered four groups.(4)The analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that the variation of N.bulbuliferum among the populations was 77.12% (P<0.01),and the variation within the population was 22.88% (P<0.01).These findings clearly evidenced the genetic relationship of Notholirion in the Hengduan Mountains.Importantly,the high diversity of N.bulbuliferum found in this study indicated that reasonable measures should be taken for the conservation and restoration for medicinal and ornamental plant species.

Key words:genetic diversity;inter-simple sequence repeats (ISSR);Notholirion bulbuliferum;N.campanulatum;N.macrophyllum

中圖分類號(hào):Q346.+5;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:楊梅(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事植物系統(tǒng)進(jìn)化研究。E-mail:meiyang100418@163.com*通信作者:周頌東,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事植物分類與系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)方面的研究。E-mail:songdongzhou@ aliyun.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31270241,31470009,31570198);國家基礎(chǔ)條件平臺(tái);國家標(biāo)本平臺(tái)教學(xué)標(biāo)本子平臺(tái)(http://mnh.scu.edu.cn);科技部基礎(chǔ)性研究專項(xiàng)(2013FY112100)

收稿日期:2015-12-02;修改稿收到日期:2016-02-01

文章編號(hào):1000-4025(2016)03-0449-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0449