陳　妍,王玲麗,2,劉文哲*

(1 西北大學 生命科學學院,西安 710069;2 運城學院 生命科學系,山西運城 044000)

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授粉對煙草花柱引導組織結構的影響

陳妍1,王玲麗1,2,劉文哲1*

(1 西北大學 生命科學學院,西安 710069;2 運城學院 生命科學系,山西運城 044000)

摘要:花柱內引導組織是花粉管生長時的必需結構,對花粉管的生長具有支持、營養(yǎng)、引導生長等重要作用。為了研究授粉對花柱引導組織結構的影響,該研究對煙草開花后不授粉及授粉1～4 d內的花柱引導組織結構動態(tài)進行了觀察比較。研究發(fā)現:未授粉花柱內的引導組織的變化是一個類似于衰老的死亡過程,授粉后花柱內引導組織細胞發(fā)生劇烈變化,細胞快速死亡,與未授粉花柱的引導組織的變化完全不同,它們可能是兩種完全不同的調控方式。

關鍵詞:煙草;授粉及不授粉;花柱引導組織;結構;DAPI

被子植物有性生殖的成功需要花粉內的精細胞分別與胚珠內的卵細胞及中央細胞結合,由于精細胞無法移動,因此,這一過程需要多種器官相互配合才能夠順利完成[1]。例如,柱頭花粉的附著、水合作用,花粉管的萌發(fā)與生長,以及兩個精細胞分別與卵細胞、中央細胞結合等過程均需要多種生殖器官參與。雙受精過程主要是在柱頭、花柱、珠柄、子房這些器官中完成的[2],其中柱頭、花柱、珠柄是花粉管生長的主要場所[3]。

花柱連接柱頭與子房,是雌性生殖器官的重要組成部分,為花粉管生長的主要部位[4]?；ㄖ饕袃煞N類型:開放型和閉合型[5]。開放型花柱是中空的,例如百合(Liliumbrownii)[6]。而閉合型花柱中充滿了特殊的薄壁細胞,它們被稱為引導組織[7]。引導組織細胞為梭形,細胞直徑小,細胞質濃厚,僅具初生壁;細胞間隙較大,其間充滿了細胞外基質,主要由多糖、脂類和糖蛋白等物質構成[8]。

對于閉合或者半閉合型花柱的植物來說,花粉管從柱頭萌發(fā)后向子房生長時,必須經過花柱內的引導組織,引導組織為花粉管的生長提供了良好的環(huán)境。目前對于引導組織的具體作用尚不明確,大部分研究認為引導組織為花粉管的生長提供了支持、營養(yǎng)以及引導花粉管的生長的作用[8-10]。但引導組織對花粉管的引導作用存在爭議,因為引導花粉管生長方向的短距離信號是由胚珠釋放的[11]。同時引導組織支持花粉管進行由頂部向基部生長這一運動的機制也尚未有研究證明[12]。此外,有研究認為引導組織也可能與某些物種的種間不親和以及自交不親和有關[13-14]。

花粉管在引導組織的生長速率要大于體外生長速率[15],說明引導組織減小了花粉管在花柱中生長的困難程度,為花粉管的生長提供了有利的條件與環(huán)境。引導組織細胞以及細胞外基質可以促進花粉管的生長。在缺少引導組織的擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體中,其結實率下降[16],說明引導組織直接影響了植物的結實率。在獼猴桃(Actinidiachinensisvar.deliciosa)和擬南芥中,花粉管生長時引導組織細胞會出現死亡,這說明引導組織的死亡可能也加快花粉管生長[16-17]。但是,對于授粉與引導組織細胞死亡間的時空關系并不清楚。

煙草(Nicotianatabacum)花柱為半實心花柱[4],且其花柱較長(4～5 cm),因此授粉后花柱細胞的變化較為緩慢。我們以煙草花柱為材料,通過與未授粉花柱比較,研究了授粉對花柱引導組織結構的影響。以闡明隨著花粉管的生長,煙草花柱內引導組織、花粉管、細胞外基質之間的時空關系,為進一步探討花粉管與引導組織之間的相互作用機制提供一定的理論證據。

1材料和方法

煙草于2014年8月種植于西北大學生物園內,開花后進行處理、取樣。

煙草的單花花期一般為4～5 d?；ǚ酃茉谑诜?5 h后到達胚珠完成受精[18]。在煙草開花前1 d,選取發(fā)育時期相同的花蕾30朵,去雄后套袋。待去雄的花蕾開放后,對15朵花進行人工授粉后套袋;另15朵不授粉套袋作為對照。分別收集上述處理后1至4 d的花柱,將其固定于2.5%戊二醛(pH 7.0)中,4 ℃保存。

取固定于2.5%戊二醛的花柱,磷酸緩沖液(pH 7.0)沖洗3次,1%鋨酸后固定3 h,磷酸緩沖液(pH 7.0)漂洗,對其進行梯度酒精脫水后用環(huán)氧樹脂包埋。Reichert-jung(Vienna Austria)超薄型切片機切片,厚度為2 μm。甲苯胺藍染色后,Nikon Eclipse 50i (Nikon Japan)顯微鏡觀察拍照。

取上述樣品,酒精梯度脫水后用石蠟包埋。Leica RM 2135石蠟切片機切片,厚度為8 μm。切片經二甲苯脫蠟,酒精梯度復水后,用DAPI對其細胞核進行染色。Leica DMLB熒光顯微鏡觀察拍照,激發(fā)波長為340～380 nm。

2結果與分析

2.1煙草花柱的結構

開花時煙草花柱的長度為4～5 cm,為了比較煙草花柱上部與下部的結構差異,我們選取煙草花柱柱頭下1 cm和子房上1 cm的部位進行橫切(圖版Ⅰ,1)。煙草的花柱由表皮、皮層、維管束和位于中央的引導組織構成(圖版Ⅰ,2、3)。由于細胞外基質易被甲苯胺藍著色,因此引導組織與周圍的組織顏色差異明顯(圖版Ⅰ,2、3)?；ㄖ喜恳龑ЫM織整體呈啞鈴型(圖版Ⅰ,2),而下部分則為圓形或者橢圓形(圖版Ⅰ,3)。雖然上、下部引導組織的形狀不同,但其引導組織細胞結構相似,細胞直徑小,細胞質濃厚,細胞間隙內充滿了易被甲苯胺藍染色的細胞外基質。

2.2未授粉煙草花柱引導組織的結構變化

通過對花開放1～4 d內花柱引導組織結構變化的比較。發(fā)現開花初期(1 d)上部引導組織呈啞鈴型,染色后著色較淺。引導組織細胞排列緊密,胞間隙小,細胞質濃厚(圖版Ⅰ,4、8)。第2天引導組織出現了明顯的變化,其細胞間隙增大,細胞外基質明顯增多(圖版Ⅰ,5、9),該現象持續(xù)到開花后3 d(圖版Ⅰ,6、10)。細胞出現明顯的死亡跡象發(fā)生在第4天,此時細胞外基質進一步增多,著色程度明顯下降(圖版Ⅰ,7),細胞液泡化明顯,細胞質出現皺縮(圖版Ⅰ,11)。

花柱下部引導組織的變化滯后于上部。開花前2 d,除形狀外,下部引導組織與上部花柱無明顯差異(圖版 Ⅰ,12、13、16、17)。從第3天開始,下部引導組織細胞進入死亡進程,其細胞間隙大小及出現部位、發(fā)生皺縮的細胞明顯少于上部引導組織(圖版Ⅰ,10、11、18、19),細胞外基質的著色情況與開花前2 d上部引導組織無顯著差別(圖版Ⅰ,4、5、14、15)。

2.3授粉后煙草花柱引導組織的結構變化

授粉后,引導組織上部細胞外基質的分泌明顯高于未授粉花柱內引導組織(圖版Ⅱ,1～16;圖版Ⅰ,4～19)。同時,引導組織細胞由于花粉管的進入發(fā)生變形(圖版Ⅱ,1、5;圖版Ⅰ,4、8)。授粉后第3天,因大部分花粉管已進入胚珠完成受精,花柱內大部分花粉管開始降解,同時上部的引導組織細胞大量降解,僅存細胞壁,只有少量細胞可見其細胞核與少量細胞器。細胞外基質變得豐富著色較深(圖版Ⅱ,3、7)。第4天,引導組織中央的細胞大部分死亡,形成了空腔(圖版Ⅱ,4、8)。

授粉后前2 d,花柱下部引導組織與上部引導組織表現出明顯的差異(圖版Ⅱ,9、10、13、14;圖版Ⅱ,1、2、5、6),而與未授粉2、3 d上部引導組織類似(圖版Ⅰ,5、6、9、10)。直至授粉后第3天,下部引導組織才出現上部授粉后1 d的變化,即引導組織細胞變形(圖版Ⅱ,11、15;圖版Ⅱ,1、5)。在此之后,下部引導組織的變化進程明顯加快,到授粉后第4天,引導組織的中央形成了一個大的空腔(圖版Ⅱ,12、16)。下部引導組織2 d內經歷的結構變化與上部4 d內的變化類似。

2.4煙草花柱引導組織的細胞核動態(tài)

為了進一步說明引導組織細胞內細胞核的動態(tài)變化,我們對未授粉和授粉花柱上部引導組織細胞核分別進行了DAPI染色。未授粉情況下,開花后第1天,引導組織細胞的大部分細胞的細胞核為球形,染色質分布均勻。只有少量的細胞有較強的熒光(圖版Ⅲ,1)。此后,引導組織內的細胞核的熒光逐漸增強(圖版Ⅲ,2),第3天,細胞核出現變形(圖版Ⅲ,3)。第4天后,大部分細胞已降解,發(fā)出熒光的細胞核明顯減少(圖版Ⅲ,4)。

授粉后,細胞核的變化更加劇烈。授粉后1 d,細胞核的熒光強度要明顯高于同一時期未授粉花柱(圖版Ⅲ,5、1),這一現象一直持續(xù)到授粉后2 d(圖版Ⅲ,6)。與未授粉花柱不同,授粉后第3天細胞核開始發(fā)生降解(圖版Ⅲ,7),至第4天細胞核幾乎完全降解(圖版Ⅲ,8)。

3討論

煙草的單花花期4～5 d,沒有授粉的花朵在開放后的4～5 d會萎蔫脫落。如果不授粉,花柱內的引導組織在1～3 d內細胞外基質逐漸增加,細胞間隙逐漸增大。到第3天引導組織內細胞外基質的分泌達到了最高值,這是引導組織等待授粉的表現,與煙草柱頭可授性維持時間相吻合[19]。在此過程中,其細胞液泡化程度增加,細胞核形狀改變和染色質凝集現象趨于明顯,一部分細胞已經開始死亡。直到花期即將結束時,大部分引導組織細胞邁入死亡的歷程。由此可見,未授粉引導組織細胞死亡過程也是一個受到調控的、有序的細胞死亡的過程。

而授粉后的引導組織與不授粉的有著截然不同的表現。授粉1 d后,上部引導組織整體形狀由啞鈴形變?yōu)殚L橢圓形,花粉管周圍的引導組織細胞變形,細胞核染色體凝聚,細胞外基質明顯增多。而下部引導組織在授粉1 d后,并沒有發(fā)生明顯變化,其形態(tài)如同未授粉的花柱。下部引導組織形態(tài)結構發(fā)生變化發(fā)生在授粉第3天。煙草授粉后,花粉管要經歷45 h才能到達子房,因而,授粉1 d后花粉管只長到花柱的2～3 cm處[20],此時上部引導組織變化及3 d后下部的變化,恰好說明引導組織細胞的形態(tài)結構變化是花粉管生長引起的。授粉第4天,不管上部還是下部,引導組織細胞大量降解,中央形成空腔。引導組織形態(tài)結構隨授粉時間的變化,是花柱內引導組織對花粉管生長做出一系列的響應,并隨著授粉的結束最終走向死亡。由此,我們認為授粉后煙草花柱引導組織的死亡是由花粉管生長所引發(fā)的,死亡信號是由花粉管生長過程所釋放,而并非授粉時所釋放的信號引起。因為授粉發(fā)生后,花粉管尚未長到的引導組織發(fā)生的變化并不明顯。

總之,煙草花柱包括其內的引導組織,不管授粉與否,在開放后第4～5天走向死亡。但其時空變化和死亡特征似乎不盡相同。未授粉的花柱內的引導組織不會立刻死亡,或者只有少部分細胞死亡,并通過釋放大量細胞外基質來等待授粉和花粉管的生長,這是植物對爭取最大受精機率的一種適應。如果一直沒有花粉管生長,引導組織會隨整個花器官的脫落而降解,而這種死亡更類似于衰老[21]。引導組織的作用是為花粉管的生長提供營養(yǎng)和物理空間[22],授粉后,特別是花粉管生長會引導組織發(fā)生劇烈的變化。我們推測,花粉管生長過程中,其頂端會釋放某種信號分子引發(fā)引導組織進入死亡程序,Wang等[23]認為花粉管生長會引起引導組織特有mRNA Poly(A)末端縮短,最終導致引導組織細胞進入死亡程序。擬南芥子房內引導組織在授粉后也發(fā)生相同的變化[16],但其花柱內的引導組織卻似乎并未發(fā)生死亡[24]。獼猴桃的柱頭臂的內引導組織在授粉后也會發(fā)生類似于煙草花柱的變化[17]。因此,授粉后花粉管生長所釋放的信號類似于側根或不定根發(fā)生時引起皮層和表皮細胞死亡的信號[25]。Gonzalez等[26]認為花粉管與花柱之間相互作用是一個類似于病原體入侵的過程。因此,引導組織與花粉管之間的相互作用機制尚需要進一步的研究。

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圖版 Ⅰ煙草花柱及未授粉花柱的結構圖(箭頭為充滿細胞外基質的細胞間隙)

TT.引導組織;CT.皮層;VT.維管組織

1.煙草花柱以及取樣的位置;2.煙草上半部分(柱頭下1 cm)的橫切片;3.煙草花柱下半部分(子房上1 cm);4～11.上部分花柱的橫切:4～7.未授粉1～4 d上部花柱的橫切;8～11.1～4 d上部引導組織的變化過程;12～19.下部分花柱的橫切:12～15.下部花柱1～4 d的橫切;16～19.1～4 d下部引導組織的變化過程。

Plate ⅠThe structure of the tobacco style and non-pollinated style(Arrow is the intercellular spaces full of the extracellular matrix)

TT.Transmitting tissue;CT.Cortex tissue;VT.Vascular tissue

Fig.1.The style of tobacco and the position of sampling;Fig.2.Photograph of transverse sections from the upper part of style;Fig.3 Photograph of transverse sections from the lower part of style;Fig.4-11.The Photographs of transverse sections from the upper part of tobacco style:Fig.4-7.The images of transverse sections from the upper part of style which are 1-4 d;Fig.8-11.The changes of the upper part of transmitting tissue (1-4 d);Fig.12-19.The transverse sections from the lower part of the style:Fig.12-15.The transverse sections of lower part of style which are flowering 1-4 d;Fig.16-19.The changes of the lower part of transmitting tissue from 1 d to 4 d.

圖版 Ⅱ煙草授粉后花柱的結構

★.空腔

1～8.授粉后1～4 d上部花柱的橫切:1～4.授粉后上部花柱在1～4 d內的結構變化;5～8.上部引導組織細胞在授粉后1～4 d的變化;9～16為授粉后1～4 d內下部花柱的橫切:9～12是授粉后下部花柱在1～4 d內的結構變化;13～16.下部引導組織細胞在授粉后1～4 d的變化。

Plate ⅡThe structure of the pollinated style

★.Cavity

Fig.1-8.The transverse sections from the upper part of style:Fig.1-4.The transverse sections from the upper part of style which are 1-4 d;Fig.5-8.The gradually changes of the upper part of transmitting tissue from 1 d to 4 d;Fig.9-16.The transverse sections from the lower part of style:Fig.9-12.The lower part of style which are flowering 1-4 d;Fig.13-16.The changes of the lower transmitting tissue from 1 d to 4 d.

圖版 Ⅲ上部引導組織細胞核動態(tài)變化

1～4.未授粉1～4 d引導組織細胞細胞核的動態(tài)變化;5～8.授粉后1～4 d引導組織細胞細胞核的動態(tài)。

Plate ⅢThe dynamic changes of nucleus of the upper part of transmitting tissue

Fig.1-4.The dynamic changes of the nucleus of transmitting tissue from non-pollinated flowers which are flowering 1-4 d;Fig.5-8.The dynamic changes of the nucleus of transmitting tissue from pollinated flowers which are flowering 1-4 d.

(編輯:潘新社)

Pollination Effects on the Structure of Tobacco’s (Nicotianatabacum) Transmitting Tissue

CHEN Yan1,WANG Lingli1,2,LIU Wenzhe1*

(1 College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069;2 Department of Life Science,Yuncheng University,Yuncheng,Shanxi 044000,China)

Abstract:The transmitting tissue of style is essential for the pollen tube growth.It involves pollen tube movement and has multiple roles in guidance,nutrition,adhesion.In order to study the pollination effect on the structure of style’s transmitting tissue,we observed the transmitting tissues which were pollinated or non-pollinated during the flowering of Nicotiana tabacum.The results showed that the cell death of transmitting tissue was similar to senescence in the non-pollinated style.However,the transmitting tissue had dramatic changes after pollination:the cells died rapidly.The dynamic changes of nucleus in the both pollination and non-pollination transmitting tissue were in accordance with the above.Overall,there are two different types of the death in transmitting tissue between pollination and non-pollination.

Key words:Nicotiana tabacum;pollination and non-pollination;transmitting tissue;structure;DAPI

中圖分類號:Q944.5

文獻標志碼:A

作者簡介:陳妍(1989-),女,碩士,主要從事結構植物學研究。E-mail:738273567@qq.com*通信作者:劉文哲,教授,博士生導師,主要從事結構植物學研究。E-mail:lwenzhe@nwu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金(31270428)

收稿日期:2015-11-25;修改稿收到日期:2016-01-26

文章編號:1000-4025(2016)03-0486-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0486