唐　綺,藺　禎,高　龍,郭　雪,王丹陽

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室,西安 710069)

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黃瓜生殖細胞分離及其線粒體DNA的觀察與拷貝數(shù)定量分析

唐綺,藺禎,高龍,郭雪,王丹陽*

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室,西安 710069)

摘要:該研究以6～8月上午10點左右摘取的新鮮黃瓜花朵為材料,采用滲透壓沖擊的方法分離黃瓜生殖細胞,并應(yīng)用競爭型定量PCR技術(shù)測定其線粒體DNA數(shù)量,分析生殖細胞在發(fā)育過程中線粒體DNA的變化,以明確高豐度線粒體DNA的來源,為進一步研究被子植物調(diào)控線粒體DNA擴增的分子機制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示:(1)DAPI染色觀察發(fā)現(xiàn),黃瓜生殖細胞的細胞核周圍存在大量的細胞器DNA熒光點,表明黃瓜生殖細胞的細胞質(zhì)中存在大量的線粒體DNA。(2)成熟黃瓜生殖細胞平均包含(1 037±126)個線粒體DNA拷貝。(3)成熟生殖細胞內(nèi)線粒體DNA含量為早期生殖細胞的14.5倍,表明成熟生殖細胞中的線粒體DNA主要來自于生殖細胞形成后其內(nèi)活躍的線粒體DNA擴增。研究認(rèn)為,黃瓜生殖細胞內(nèi)活躍的線粒體DNA是黃瓜線粒體父系遺傳的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:線粒體DNA;拷貝數(shù);父系遺傳;黃瓜;生殖細胞

植物細胞3個攜帶DNA的細胞器——細胞核、質(zhì)體及線粒體以不同的方式傳遞DNA到下一代。不同于細胞核的雙親遺傳,葉綠體與線粒體普遍呈現(xiàn)母系遺傳,尤其是線粒體,顯現(xiàn)出更為嚴(yán)格的母系遺傳[1-2]。在迄今所研究過的植物中,只有甜瓜、天竺葵、香蕉及黃瓜等少數(shù)物種呈現(xiàn)雙親或者父系線粒體遺傳的特征[3-5]。由于線粒體是攜帶DNA的細胞器,因此,線粒體遺傳的本質(zhì)是線粒體DNA的遺傳。細胞學(xué)研究結(jié)果表明:對于線粒體雙親或者父系遺傳的物種,其生殖細胞或精細胞總是攜帶豐富的線粒體DNA;而對于母系遺傳的物種,則幾乎不攜帶DNA[6]。因此,線粒體DNA含量與線粒體遺傳模式呈現(xiàn)出高度的相關(guān)性。

對于那些雙親或者父系遺傳的物種,其生殖細胞或精細胞都包含線粒體DNA,細胞學(xué)方法難以對線粒體DNA含量進行準(zhǔn)確的測量。以前的研究運用定量PCR技術(shù)測量了天竺葵精細胞及甜瓜生殖細胞中線粒體DNA含量[7]。結(jié)果顯示:對于雙親遺傳的天竺葵,其精細胞所攜帶的線粒體DNA數(shù)量為(256.7±71.2)個;而對于父系遺傳的甜瓜,其生殖細胞所攜帶的則為(1 296.3±310.6)個。這些定量結(jié)果與這兩個物種的線粒體遺傳模式呈現(xiàn)出高度的一致性,即父系遺傳的甜瓜在生殖細胞中線粒體DNA含量遠高于雙親遺傳的天竺葵在精細胞中的線粒體DNA含量。因此,定量研究結(jié)果能為我們理解線粒體的遺傳模式提供更為精細的實驗數(shù)據(jù)。

黃瓜,作為少數(shù)幾個線粒體父系遺傳的物種之一,對其生殖細胞中線粒體DNA含量的測定還未見報道。本研究通過分離黃瓜生殖細胞,應(yīng)用競爭型定量PCR技術(shù)測量了其內(nèi)線粒體DNA含量,分析生殖細胞在發(fā)育過程中線粒體DNA的變化,以明確高豐度線粒體DNA的來源,為進一步研究被子植物調(diào)控線粒體DNA擴增的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實驗材料

實驗材料黃瓜(C.sativus)在自然條件下于4～8月種植于西北大學(xué)果園。新鮮的黃瓜花朵取自上午10:00左右,摘取后立即進行后續(xù)的實驗。

1.2方法

1.2.1花粉DAPI壓片在載玻片上,將新鮮花粉置于1滴DAPI(0.1 μg/mL)與固定液(4%多聚甲醛,2%戊二醛,0.1 mol/L二甲砷酸鈉)的混合液中靜置30 s。蓋上蓋玻片后,輕輕用力向一個方向擠壓。花粉內(nèi)容物因受力而被擠壓出花粉。用萊卡倒置顯微鏡DMI3100觀察壓片,用彩色CCD獲取圖像。

1.2.2生殖細胞的分離生殖細胞的分離采用滲透壓沖擊的方法[8]。將新鮮成熟花粉富集于35%蔗糖溶液中,經(jīng)過1 min離心后(100×g),將上清換成15%蔗糖溶液以進行滲透壓沖擊。在滲透壓變化的沖擊下,花粉將從萌發(fā)孔處釋放包含生殖細胞的內(nèi)容物。將生殖細胞在倒置顯微鏡下用玻璃毛細管于15%蔗糖溶液中清洗3遍后進行富集。生殖細胞的活力用FDA染色方法進行檢測。細胞于0.01% FDA溶液中進行5 min染色后,置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3生殖細胞的消化處理將富集的黃瓜生殖細胞轉(zhuǎn)移至PCR管中進行消化處理。在消化前,細胞首先經(jīng)過快速凍融處理以破裂細胞膜。消化液的組成為0.2×Taq酶緩沖液(天根),50 μg/mL蛋白酶K(Merck)。消化條件:56 ℃過夜處理。消化液的用量為每個生殖細胞添加2 μL。

1.2.4定量PCR消化液經(jīng)過95 ℃變性處理5 min以滅活其中的蛋白酶K。競爭型定量PCR用于定量實驗[7,9]。定量PCR包括2輪PCR擴增。在第1輪PCR擴增中,首先,按普通PCR反應(yīng)配制5個反應(yīng),組分包括1×Taq酶緩沖液、0.2 mmol/L dNTPs、0.6 UTaq酶、雙蒸水及0.4 mmol/L引物對(CmQan1F/CmQan1R)[7];其次,向每個PCR反應(yīng)液中加入2 μL消化液作為模板,其對應(yīng)于單個生殖細胞中的線粒體DNA數(shù)量;最后,向每個PCR管中加入不同數(shù)量的競爭模板cmmatR-(競爭模板cmmatR-來自甜瓜線粒體DNA上的基因matR。由于甜瓜的matR在序列上與黃瓜的matR完全一致,所以cmmatR-也可以用于黃瓜的定量實驗。與matR片段相比,cmmatR-缺失了其內(nèi)部的113 bp。在定量PCR反應(yīng)中,由cmmatR-與matR所擴增出的PCR產(chǎn)物大小不同,由此可以在凝膠上進行區(qū)分)[7]。PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共20個循環(huán)。該反應(yīng)結(jié)束后,進行第2輪PCR擴增。以第1輪的反應(yīng)液1 μL做為第2輪PCR模板,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為22個循環(huán)。其它反應(yīng)條件如上,僅將引物對換成CmQan2F/CmQan2R[7]。

拷貝數(shù)的計算根據(jù)2次PCR擴增條帶的灰度值比進行。首先,計算5個PCR反應(yīng)中2條帶的灰度值比;其次,找出灰度值比接近修正系數(shù)0.64的PCR反應(yīng)(修正系數(shù)為當(dāng)定量模板與競爭模板為1∶1時,其擴增的兩PCR產(chǎn)物的灰度值比)[7];最后,用該PCR反應(yīng)來計算線粒體DNA的拷貝數(shù),方法為該PCR反應(yīng)的競爭模板的數(shù)量乘以“灰度值比與修正系數(shù)”之比。

1.2.5DiOC7/DAPI染色早期的兩核花粉及成熟花粉于固定液中室溫固定4 h。固定液組成為:4%多聚甲醛,2%戊二醛,0.1 mol/L 二甲砷酸鈉。固定的樣品經(jīng)乙醇脫水后,于Technovit3040樹脂中進行滲透、聚合。實驗流程按產(chǎn)品廠家建議進行。

500 nm厚的切片先于1 μg/mL DiOC7溶液中染色3 min,用蒸餾水清洗2 min后,再于0.1 μg/mL DAPI溶液中染色6 min[6]。所有圖像均在同等條件下拍照獲取,以方便后續(xù)DNA含量變化的分析。

為了比較早期生殖細胞與成熟生殖細胞中線粒體DNA變化,統(tǒng)計了這兩個發(fā)育時期單個線粒體中的DNA含量變化以及整個生殖細胞中的線粒體數(shù)目變化。單個線粒體內(nèi)的DNA含量變化對應(yīng)于切片上這兩個時期單個DAPI點的平均灰度值之比(灰度值在Photoshop中進行計算);而線粒體數(shù)目的變化則對應(yīng)于相同細胞質(zhì)面積內(nèi)DAPI點的數(shù)量之比,細胞質(zhì)面積在Photoshop中可以用總像素點來表示?？偟木€粒體DNA含量變化則用單個線粒體的DNA含量變化與線粒體數(shù)目變化之積來表示。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜生殖細胞內(nèi)的細胞器DNA

用花粉壓片結(jié)合DAPI染色技術(shù)檢測結(jié)果顯示,黃瓜生殖細胞的細胞核周圍存在大量的熒光點(圖1,A,箭標(biāo)所示),這些核外的熒光點暗示了細胞器DNA的存在。而對照擬南芥精細胞的細胞核周圍并無明顯的點狀熒光信號(圖1,B)。由于遺傳學(xué)證據(jù)已經(jīng)顯示黃瓜為線粒體父系遺傳物種[3],因此,這些點狀的熒光信號暗示了線粒體DNA的存在。

盡管黃瓜生殖細胞與擬南芥精細胞在核外細胞器DNA上的DAPI染色結(jié)果不同,但是,它們在花粉營養(yǎng)細胞中的染色結(jié)果卻是相似的,即都不包含可見的細胞器DNA(圖1,A、B)。這暗示這2個物種的花粉營養(yǎng)細胞僅攜帶少量的細胞器DNA,其含量已經(jīng)低于DAPI染色所能觀察到的范圍。這與前期的觀察結(jié)果是一致的[6]。

2.2黃瓜生殖細胞的分離

為了對成熟黃瓜生殖細胞中的線粒體DNA含量進行準(zhǔn)確的測量,我們首先分離、純化了該細胞。在滲透壓變化的沖擊下,生殖細胞會伴隨營養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)從花粉萌發(fā)孔處釋放到花粉外(圖2,A箭頭所示)。這些游離的生殖細胞可以通過玻璃毛細管進行小規(guī)模富集,圖2,B顯示了富集的29個生殖細胞。FDA染色顯示,分離的生殖細胞在2 h后仍具細胞活力(圖2,C、D)。

A.箭頭所示黃瓜生殖細胞(GC)的細胞質(zhì)中存在大量的

A.剛從花粉釋放的生殖細胞;B.富集的29個生殖細胞;C、D.FDA染色以指示

2.3黃瓜生殖細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)的定量

分離得到的29個生殖細胞,在經(jīng)過快速的凍融處理后,于58 μL消化液中進行消化處理以釋放模板DNA。2 μL消化產(chǎn)物(平均對應(yīng)于1個生殖細胞)被用來作為單個定量PCR反應(yīng)的模板。在每次的定量實驗中,設(shè)置5個定量PCR反應(yīng)。每個PCR反應(yīng)除了包含相同數(shù)量的線粒體DNA模板(數(shù)量未知)外,還包含不同數(shù)量的競爭模板cmmatR-(競爭模板的數(shù)量是已知的)。從PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果可以看見,隨著競爭型模板的逐漸增加,由其擴增而來的PCR產(chǎn)物的條帶亮度逐漸遞增(339 bp條帶),同時,由線粒體DNA擴增而來的條帶亮度逐漸減弱(452 bp)。這表明兩擴增產(chǎn)物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出明顯的競爭關(guān)系,暗示了定量結(jié)果是可靠的。選取了兩PCR條帶灰度值比接近參考系數(shù)(0.64)的PCR反應(yīng)來計算線粒體DNA的拷貝數(shù)(圖3,A～C)。3次實驗結(jié)果分別為1 093個、893個及1 125個。因此,單個黃瓜生殖細胞平均攜帶的線粒體DNA拷貝數(shù)為(1 037±126)個。

圖3　黃瓜生殖細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的定量分析

A、B.顯示早期生殖細胞的DiOC7(A)及DAPI(B)染色;C、D.顯示成熟生殖細胞的DiOC7(C)及DAPI(D)染色;

2.4生殖細胞中線粒體DNA的擴增

為了調(diào)查成熟生殖細胞產(chǎn)生如此高豐度線粒體DNA的原因,比較了早期生殖細胞與成熟生殖細胞中的線粒體DNA含量。生殖細胞最早出現(xiàn)于小孢子第一次不對稱有絲分裂,這次分裂產(chǎn)生了1個體積較大的營養(yǎng)細胞和1個體積較小的生殖細胞(早期生殖細胞)。鑒于早期生殖細胞難以分離,運用切片技術(shù)與DiOC7/DAPI染色來研究線粒體DNA的變化。在切片上,DiOC7染色能夠顯示生殖細胞中的線粒體(圖4,A和C中M所示),其相對應(yīng)的DAPI點能指示線粒體DNA的含量(圖4,B、D箭頭所示)。結(jié)果顯示:成熟生殖細胞中的DAPI染色點在熒光信號上是早期生殖細胞的4.4倍(圖4,E),同時,成熟生殖細胞中的熒光點在單位面積上出現(xiàn)的頻率是早期生殖細胞的3.3倍,暗示總的線粒體數(shù)目增加了3.3倍(圖4,F)。因此,在發(fā)育過程中,成熟生殖細胞中的線粒體DNA含量增加為早期生殖細胞的14.5倍。這表明成熟生殖細胞中的線粒體DNA主要來自于生殖細胞形成后其內(nèi)活躍的線粒體DNA擴增。

3討論

在本研究中,我們定量分析了黃瓜生殖細胞中的線粒體DNA數(shù)量。黃瓜生殖細胞平均攜帶(1 037±126)個線粒體DNA拷貝。這與同屬植物甜瓜生殖細胞的線粒體DNA含量相似(1 296±310)[7]。如此高豐度的線粒體DNA主要來自于生殖細胞內(nèi)活躍的線粒體DNA擴增。這包括兩方面的原因:單個線粒體內(nèi)DNA含量的增加以及生殖細胞內(nèi)總線粒體數(shù)量的增加。這可能是黃瓜線粒體父系遺傳的主要原因。

基因組測序結(jié)果表明,黃瓜核基因組和線粒體基因組的大小分別為243.5 Mb與1 568 kb[10-11]。在成熟生殖細胞中(核基因組的復(fù)制已經(jīng)完成),其核DNA的含量為487 Mb,而線粒體DNA的含量為1 626.0 Mb(1 037×1 568 kb)。因此,黃瓜生殖細胞所攜帶的線粒體DNA含量是其核DNA含量的3.3倍。這種核外線粒體DNA含量大于核DNA含量的現(xiàn)象在植物細胞中并不常見。目前,僅在天竺葵卵細胞中報道過[12]?？紤]到核基因組與線粒體基因組共用了一些與DNA復(fù)制相關(guān)的原料,這提示生殖細胞中可能存在某種機制使得線粒體能高效地利用DNA復(fù)制所需要的各種物質(zhì)。

在被子植物中,體細胞平均攜帶約50個線粒體DNA拷貝[7,13]。在體細胞的分裂過程中,線粒體DNA僅復(fù)制1倍后平均分配到2個子細胞中。目前,我們并不清楚是什么機制維持了體細胞中的線粒體DNA僅發(fā)生1倍的增加？但是,與體細胞不同,黃瓜生殖細胞卻發(fā)生了14.5倍的線粒體DNA擴增。這表明體細胞中維持線粒體DNA數(shù)量的機制在黃瓜生殖細胞中并不能正常行使功能。因此,在黃瓜生殖細胞中,可能存在或者缺失了某些因子,使得線粒體DNA發(fā)生了超量復(fù)制。解析這些因子,有助于我們理解線粒體DNA數(shù)量控制的基本生命科學(xué)問題。近來,研究者們已用RT-PCR方法從分離的百花丹與煙草精細胞構(gòu)建了各自的cDNA文庫[14-15],進而解析了大量精細胞表達的基因。利用該方法并結(jié)合黃瓜生殖細胞的分離技術(shù),使得我們可以獲得黃瓜生殖細胞的轉(zhuǎn)錄組;同時,鑒于黃瓜基因組的測序已經(jīng)完成,這使得我們可以利用黃瓜生殖細胞作為實驗材料來研究被子植物調(diào)控線粒體DNA擴增的分子機制。

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(編輯:宋亞珍)

Isolation of Generative Cell ofCucumissativusand Mitochondrial DNA Observation and Copy-number Quantification Analysis

TANG Qi,LIN Zhen,GAO Long,GUO Xue,WANG Danyang*

(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract:In this study,we collected fresh flowers from Cucumis sativus around 10:00(am) from June to August,isolated the generative cells (GC) of C.sativus with the method of osmotic shock,quantified its mitochondrial DNA (mtDNA) contents through employing the competitive quantitative PCR technology,and analyzed the change of mtDNA contents in GC during its development,in order to investigate the origin of the abundant mtDNA,and lay the foundation for further study on the molecular mechanism of regulation of mitochondrial DNA amplification in angiosperm.The results showed that:(1)DAPI staining represents abundant fluorescence points of organellar DNA around the nucleus of GC of C.sativus,indicating the presence of a large number of mtDNA in cytoplasm of cucumber GC.(2)The single mature GC of C.sativus averagely owns (1 037±126) mtDNA copies.(3)Compared with early GC,the mature GC up-regulates the mtDNA by 14.5 times,suggesting that mtDNA in mature GC is mainly from its active amplification after GC formation.The study suggests that the active increase of mtDNA in GC is the basis of the paternal mitochondrial inheritance of C.sativus.

Key words:mtDNA;copies;paternal inheritance;Cucumis sativus;generative cell(GC)

中圖分類號:Q349+.51;Q753

文獻標(biāo)志碼:A

作者簡介:唐綺(1991-),女,碩士,主要從事被子植物生殖生物學(xué)研究。E-mail:583208677@qq.com*通信作者:王丹陽,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事被子植物生殖生物學(xué)研究。E-mail:wangdy@nwu.edu.cn

基金項目:國家自然科學(xué)基金(31200234);陜西省教育廳科研計劃(14JS089)

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-01-17

文章編號:1000-4025(2016)03-0429-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0429