楊怡 李秀川 裴海峰 邱琛茗 黃容

MICU1在心肌缺血損傷中的保護作用*

楊怡 李秀川 裴海峰 邱琛茗 黃容

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科, 四川 成都 610083)

目的 探討線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1)在心肌缺血損傷中是否能夠發(fā)揮保護作用及其相關機制。方法 利用心肌點注射siRNA技術敲低心肌組織中的MICU1水平。48小時后，通過結扎小鼠冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型。結扎24小時后，利用western blot 檢測心肌組織中的MICU1含量；利用離子火焰法測定心肌細胞線粒體中Ca2+水平。結扎72小時后，利用JC-1試劑盒及ATP試劑盒分別檢測心肌細胞線粒體膜電位及ATP水平；利用Caspase-3試劑盒測定心肌細胞凋亡水平；利用小動物超聲檢測小鼠心臟功能。結果 缺血明顯地降低了心肌細胞線粒體膜電位水平，并減少了線粒體ATP生成(均P<0.01)。同時缺血顯著地增加了心肌細胞線粒體內(nèi)Ca2+含量，并降低了線粒體中MICU1的表達(均P<0.01)。通過基因干預手段我們發(fā)現(xiàn)，MICU1的敲低明顯加重了缺血誘導的線粒體Ca2+超載與線粒體功能抑制(均P<0.01)。另外，MICU1的缺失顯著地增加了缺血誘導的心肌細胞凋亡與心功能損傷(均P<0.01)。結論 MICU1能夠通過抑制線粒體Ca2+超載來減輕缺血后心肌損傷。

心肌梗死； 線粒體； MICU1； Ca2+超載

心肌梗死( myocardial infarction, MI)發(fā)病率高，死亡率高，嚴重威脅著人們的生命安全和生活質(zhì)量[1，2]。在心肌缺血過程中及缺血后，線粒體會出現(xiàn)Ca2+超載，功能受損，最終導致心肌細胞壞死或凋亡[3]。另有資料表明，線粒體鈣離子攝入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)可以通過抑制線粒體Ca2+運輸?shù)鞍?mitochondrial Ca2+uniporter, MCU)所介導的Ca2+轉運而調(diào)控細胞存活，其缺失會導致MCU攝入過多Ca2+，過度生成超氧陰離子，進而增加細胞凋亡[4]。為進一步明確MICU1對心肌缺血損傷的影響，我們建立了心肌梗死小鼠模型，深入挖掘MICU1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF/ VAF級雄性C57BL6/J小鼠[SCXK(京2014-0001) 北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF/ VAF級]，體重22～25g,鼠齡10～12周。試劑：JC-1試劑盒購于Invitrogen公司； ATP試劑盒購自中國Beyotime； Casepase-3試劑盒購自南京凱基； MICU1 siRNA 購于GenePharma公司；抗MICU1抗體購于美國Immunoway公司； PVDF膜購自美國Milipore公司。建立心肌梗死合并MICU1降低小鼠模型后分為4組(n=8)：①Sham(健康對照組)。②MI (心梗組)。③Control(亂碼RNA對照組)。 ④Mkd(心梗+MICU1降低組)。

1.2 方法

1.2.1 MICU1降低及心梗小鼠模型建立 經(jīng)小鼠左胸前第4～5肋間暴露心臟，將MICU1 siRNA(20μg)注射于左室心肌壁內(nèi)，然后將心臟放回胸腔，排空胸腔氣體，并荷包縫合傷口。48小時后，基因干預效率達到峰值，而后通過結扎左冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，心電圖顯示心肌有缺血表現(xiàn)，即證明造模成功。

1.2.2 線粒體膜電位測定 于心梗72小時后，采用JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位，按試劑盒說明進行操作。當膜電位水平較高時， JC-1主要以聚合體形式存在，呈紅色熒光；當膜電位水平較低時，主要以單體形式存在，呈綠色熒光。通過Image Pro Plus 圖像分析軟件測定細胞內(nèi)的紅色和綠色熒光強度，相對定量線粒體膜電位水平。

1.2.3 線粒體ATP水平測定 于心梗72小時后，將心肌組織裂解后12 000g離心5min，取上清液，按照ATP試劑盒說明書進行操作，結果以nmol/mg線粒體蛋白質(zhì)表示。

1.2.4 線粒體Ca2+測定 于心梗24小時后，將心肌細胞線粒體懸液1.5ml 置于10ml的試管中，加入5ml濃硝酸，陰暗處消化1周，然后用烘箱加熱使硝酸分解蒸發(fā)，并加入1%的氯化鑭至10ml,混勻即成待測品。在原子吸收分光光度計(AA26601F ,日本島津)上用火焰原子吸收法檢測Ca2+濃度，結果以μg/ mg 線粒體蛋白質(zhì)表示。

1.2.5 MICU1表達水平檢測 心梗24小時后，取50μg蛋白樣品，用SDS-PAGE電泳分離，然后轉至PVDF膜上，于5%牛奶中室溫封閉1小時。再用抗MICU1抗體 (1∶500)孵育，于4℃過夜。洗膜后再用二抗孵育(37℃)1小時，然后發(fā)光并分析結果。

1.2.6 心肌細胞凋亡水平及心臟功能檢測 心梗72小時后，采用Casepase-3試劑盒測定細胞凋亡水平，按試劑盒說明進行操作；采用小動物超聲系統(tǒng)測定小鼠左心室射血分數(shù)(LVEF)。

2 結果

圖1 缺血誘導心肌線粒體損傷

Figure 1 Myocardial ischemia induced myocardial mitochondrial damage

2.1 缺血誘導心肌線粒體損傷 結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，缺血明顯地降低了心肌線粒體膜電位及心肌線粒體ATP水平，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),見圖1。

2.2 缺血誘發(fā)心肌線粒體內(nèi)Ca2+超載，降低線粒體中MICU1表達 結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，缺血心肌線粒體內(nèi)Ca2+含量明顯增加，但MICU1水平則顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見圖2。

圖2 缺血誘發(fā)心肌線粒體內(nèi)Ca2+超載，降低線粒體中MICU1表達

Figure 2 Myocardial ischemia lead to Ca2+overload and MICU1 decreased in the mitochondria

2.3 MICU1缺失惡化缺血誘導的線粒體Ca2+超載，加重缺血誘導的線粒體損傷 在MICU1基因敲低小鼠造模成功的基礎上，我們疊加心肌梗死模型。與對照組比較，MICU1缺失加重了缺血造成的線粒體Ca2+超載，并且明顯地降低了心肌線粒體ATP水平，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見圖3。

圖3 MICU1缺失惡化線粒體內(nèi)Ca2+超載，加重缺血誘導的線粒體損傷

Figure 3 MICU1 deficiency exacerbated Ca2+overload in the mitochondria and aggravated mitochondrial injury induced by ischemia

圖4 MICU1缺失加重心肌缺血損傷

Figure 4 Downregulation of MICU1 aggravated myocardial ischemia injury

2.4 MICU1缺失加重心肌缺血損傷 心肌梗死3天后，使用Caspase-3 試劑盒及小動物超聲分別檢測心肌細胞凋亡水平和心臟功能。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，MICU1降低的心梗小鼠中，Caspase-3活性明顯增高，心臟功能顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見圖4。

3 討論

心肌梗死是一種常見的心血管疾病，目前已成為西方國家致死和致殘的主要原因[5]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)推測，到2020年，急性心肌梗死將從全球?qū)е滤劳龅牡谖宕笤蛏仙秊榈谝淮笤騕6]。在我國，每年新發(fā)心肌梗死至少50萬人，至2012年，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國患心肌梗死人數(shù)已達到250萬人，并且給家庭和社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔[7]。因此，深入研究心肌缺血損傷的干預靶點和治療措施是很有必要的。

Ca2+作為重要的信號分子參與或調(diào)節(jié)細胞的分泌、分裂、收縮、興奮、凋亡等重要活動，但過多的Ca2+進入線粒體會引發(fā)細胞的死亡[8]。有文獻報道，Ca2+超載與線粒體功能障礙、細胞死亡、缺血損傷等有關[9～11]。目前的研究認為，Ca2+超載與氧自由基過度生成是造成心肌缺血損傷的主要原因[3]，然而其確切機制及治療靶點仍有待進一步研究。資料表明，MICU1作為線粒體Ca2+攝取過程中的一個關鍵調(diào)控蛋白，可以與MCU相互作用[12]。并且MICU1缺失會導致MCU攝入過多的Ca2+，造成Ca2+超載，過度生成超氧陰離子，進而增加細胞凋亡[4]?？傊?，由于MICU1能夠調(diào)控Ca2+攝入，且Ca2+超載被認為與心肌缺血性損傷有關，說明MICU1可能參與了心肌缺血性損傷這一病理過程。因此，為了驗證這一假說，我們建立了心肌梗死小鼠模型。結果發(fā)現(xiàn)，心肌缺血導致了線粒體損傷。為了闡釋這一病理過程是否與線粒體Ca2+超載有關，我們通過可靠的實驗方法檢測了缺血心肌中的Ca2+含量。結果表明，心肌缺血導致了線粒體Ca2+超載，并且顯著地抑制了Ca2+攝取調(diào)節(jié)蛋白MICU1的表達。這些結果與早前的研究一致[9]，提示MICU1所介導的Ca2+超載與心肌缺血性損傷有關。為了進一步明確MICU1在心肌缺血性損傷中的作用，給予心梗小鼠心肌點注射特異性siRNA來降低心肌MICU1水平。然后再觀察MICU1對心肌梗死的影響。結果發(fā)現(xiàn)，MICU1缺失惡化了線粒體內(nèi)Ca2+超載，加重了缺血誘導的線粒體損傷。同時MICU1缺失顯著地加重了缺血后心肌細胞凋亡與心功能損傷。

4 結論

MICU1能夠減輕缺血性心肌損傷，并且這一過程可能是通過抑制線粒體Ca2+超載來實現(xiàn)的。這為心肌缺血損傷的防護提供了新的理論機理，提示MICU1有可能作為新的干預靶點來研究。

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MICU1 protects against myocardial infarction injury

YANG Yi,LI Xiuchuan,PEI Haifeng,etal

(DepartmentofCardiovascularMedicine,GeneralHospitalofChengduMilitaryArea,Chengdu610083,China)

Objective To investigate whether MICU1 (mitochondrial calcium uptake1) attenuates myocardial ischemia injury and underlying mechanism. Methods MICU1 Specific small interfering RNA (siRNA) was delivered through intramyocardial injection to knockdown MICU1 levels. After 48 hours, a mice model of myocardial infarction was induced by ligating left anterior descending branch of coronary artery. After 24 hours’ ligation, MICU1 levels were determined by western blot. The mitochondrial Ca2+contents measured via atomic absorption flame spectroscopy. After 72 hours’ ligation, mitochondrial membrane potential and ATP contents were detected by JC-1 assay kit and ATP assay kit, respectively; cell apoptosis assessed by caspase-3 activity assay and cardiac function determined by ultrasound. Results Mitochondrial membrane potential, ATP contents in mice subjected to myocardial infarction were decreased (P<0.01). Meanwhile, myocardial ischemia injury significantly increased mitochondrial Ca2+contents but decreased MICU1 levels (P<0.01). With method of genetic intervention, we found that MICU1 deficiency exacerbated mitochondrial Ca2+overload and suppressed mitochondrial function (P<0.01). Furthermore, MICU1 deficiency aggravated mitochondrial ATP contents and cardiac function induced by ischemia (P<0.01). Conclusion MICU1 protects against myocardial ischemia injury induced by Ca2+overload.

Myocardial infarction; Mitochondria; MICU1; Ca2+overload

國家自然科學基金(81500208; 81470396)；四川省科技支持計劃項目(2015JY0277)；全軍醫(yī)學科技青年培育項目(14QNP050)

裴海峰，Email：web2010@foxmail.com

R -33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.007

2015-12-01；修回日期： 2016-02-17； 編輯： 母存培)