馮志山 趙夢川 王樂 李貴霞 陶曙光 溫琳琳 王琨 馬學(xué)軍

·論著·

GeXP多重分析技術(shù)對四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與先天性心臟病相關(guān)性的研究

馮志山 趙夢川 王樂 李貴霞 陶曙光 溫琳琳 王琨 馬學(xué)軍

目的 利用GeXP多重分析技術(shù)，探討四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)多態(tài)性與先天性心臟病相關(guān)性。方法 收集2013年2月至2014年12月河北省兒童醫(yī)院心臟外科手術(shù)的261例先心病患兒及49例健康對照兒童外周血，提取全血DNA，使用GeXP多重測序平臺的多重分析技術(shù)對其MTHFR基因上的兩個易感位點rs1801131和rs1801133進行基因分型，采用SPSS 16.0軟件的χ2檢驗，分析先心病與MTHFR基因多態(tài)性的相關(guān)性。結(jié)果 GeXP多重測序平臺可同時測量2個SNP的四種基因型，先心病組與對照組MTHFR677C/T等位基因和基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.853，P=0.356；χ2=0.898，P=0.343)。結(jié)論 GeXP多重分析平臺是篩查先心病易感基因特異性良好、操作簡便的多重分析技術(shù)，本研究入選的先心病患兒與健康對照MTHFR等位基因或其基因型分布無顯著性差異，為后期大樣本量探尋先心病發(fā)病易感基因起到啟示作用和奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

先天性心臟?。粊喖谆臍淙~酸還原酶；兒童

先天性心臟病(先心病)是一種嚴重威脅兒童健康的出生缺陷[1,2]，發(fā)病率6%～9%，每年將有10多萬先心病患兒出生，也是造成孕期流產(chǎn)、死胎的主要原因，給家庭和社會帶來沉重負擔[3]。先心病病因尚未完全闡明，但多數(shù)學(xué)者認為，少數(shù)是單基因突變和染色體畸變引起，大多數(shù)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的多基因遺傳病[4]。針對先心病易感基因已開展大量研究，仍有約3/4的患者致病基因不明[5]，因此，尋找先心病相關(guān)基因、易感基因十分必要。本研究使用前期建立的一種簡便快捷、特異性強、可同時檢測多個單堿基突變和單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點的GeXP多重檢測方法，對261例先心病患兒和49例健康兒童亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因上的兩個易感位點rs1801131和rs1801133進行基因分型，分析先心病與MTHFR基因多態(tài)性的相關(guān)性，篩選先心病發(fā)病相關(guān)基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年2月至2014年12月在河北省兒童醫(yī)院心臟外科確診的261例先心病患兒(先心病組)，所有入選患兒均經(jīng)術(shù)前超聲心動圖和術(shù)中確認先心病類型及其嚴重程度；其中單純型先心病186例，復(fù)雜型先心病70例，均排除因染色體異常而導(dǎo)致的綜合征或其他先天疾病的患兒；其中男121例，女140例;年齡中位數(shù)1.3歲(四分位數(shù)0.6～3.1歲)。選擇同期河北省兒童醫(yī)院兒童保健科健康體檢的兒童49例(對照組)，男31例，女18例；年齡中位數(shù)1.9歲(四分位數(shù)1.0～3.4歲)；經(jīng)心外科醫(yī)生及超聲心動圖排除先心病，且根據(jù)體檢結(jié)果及病史確認無其他先天性疾病和遺傳因素；2組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.121，P=0.904)。入選先心病患兒術(shù)前及健康兒童均采集枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈全血1 ml -80℃保存，用于DNA提取。所有入組對象為無親緣關(guān)系的中國北方人群散發(fā)病例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并由兒童父母簽署知情同意書。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗表明，rs1801131和rs1801133在對照組中檢驗結(jié)果分別為(χ2=2.749，P>0.05；χ2=2.208，P>0.05)，說明樣本具有較好的群體代表性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器:核酸自動提取試劑盒(臺灣圓點奈米技術(shù)有限公司)，膠回收試劑盒和質(zhì)粒小體試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)，pMD18-T 載體克隆試劑盒、10×上樣液、DL 1 000 DNA Marker(大連寶生物公司)，dNTP、MgCl2、PCR buffer、Taq DNA 聚合酶(美國Sigma公司)。磁珠式核酸提取儀Smart LabAssist-32(臺灣圓點奈米技術(shù)有限公司)，K5600超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，Veriti 96孔PCR儀(美國ABI公司)，GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2.2 SNPs的選擇:根據(jù)本課題組前期研究和文獻已報道的與先心病相關(guān)的MTHFR基因，在其上選取兩個陽性位點，其最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)大于5%，做哈迪溫伯格平衡檢驗。

1.2.3 引物設(shè)計:通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得兩突變位點前后各500 bp的基因序列，以此為模板，使用Primer Premier 6.0軟件進行引物設(shè)計，使擴增后的產(chǎn)物長度不同。在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(universal tag)，構(gòu)成特異性嵌合引物，嵌合引物擴增出的預(yù)期片段長度不同，可被毛細管電泳區(qū)分。引物由上海英濰捷基公司合成。見表2。

表2 GeXP多重測序平臺所用引物信息

1.2.4 基因測序:上樣板的檢測孔中分別加入38.5 μl 上樣溶液、0.5 μl DNA分子長度標準品和 1 μl PCR產(chǎn)物，每孔加1滴礦物油；同時分離板中與樣品板相對應(yīng)位置每孔加入220 μl分離溶液，使用無DNA水和攜帶相應(yīng)DNA的質(zhì)粒分別作陰性對照和陽性對照，按上述方法預(yù)處理后采用GeXP分析平臺多重分析技術(shù)完成基因測序。具體細節(jié)參見本課題組已發(fā)表文章的材料與方法部分[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因位點多態(tài)性 rs1801131位點對照組A和C等位基因分別占85.7%和14.3%；先心病組A和C等位基因分別占85.4%和14.6%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.006，P=0.937)。rs1801133位點對照組C和T等位基因分別占34.7%和65.3%；先心病組C和T等位基因分別占30.0%和70.0%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.853，P=0.356)。見表3。

表3 2組MTHFR基因兩等位基因位點多態(tài)性比較

2.2 基因型多態(tài)性

2.2.1 多態(tài)性隱形模型中:rs1801131位點對照組AA和AC+CC基因型分別占71.4%和28.6%；先心病組AA和AC+CC基因型分別占75.5%和24.5%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.360，P=0.549)。rs1801133位點對照組CC和CT+TT基因型分別占12.2%和87.8%；先心病組CC和CT+TT基因型分別占8.2%和91.8%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.898，P=0.343)。見表4。

表4 2組MTHFR基因隱形模型多態(tài)性的比較

2.2.2 多態(tài)性顯形模型:rs1801131位點在對照組和先心病組都未見CC型純合子，所以對比的χ2值空缺。rs1801133位點對照組TT和CT+CC基因型分別占42.9%和57.1%；先心病組TT和CT+CC基因型分別占48.6%和51.4%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.551，P=0.458)。見表5。

表5 2組MTHFR基因顯形模型多態(tài)性比較

3 討論

單核苷酸多態(tài)SNP是繼限制性片段長度多態(tài)性和短串聯(lián)重復(fù)序列這兩種遺傳標記之后的第三代DNA分子標記。近年來已被廣泛應(yīng)用于胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及鑒定中[7,8]。MTHFR是一種重要的葉酸代謝酶，MTHFR缺陷不僅可以引起心血管系統(tǒng)的多種疾病，而且會導(dǎo)致體內(nèi)致畸性物質(zhì)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)蓄積。MTHFR基因具有多態(tài)性，最常見的為677位點C-T改變，使酶的活力降低50%左右，可導(dǎo)致DNA甲基化水平降低以及體內(nèi)Hcy水平增高[9]。MTHFR上兩個SNP位點與先心病發(fā)生的相關(guān)性多有報道，但結(jié)果差異性很大，陽性、陰性結(jié)果皆有報道[10,11]。目前，現(xiàn)有的單個堿基突變和SNP的分析方法存在通量低、工作量大、周期長，且大多操作復(fù)雜，費用昂貴，不適合大樣本多位點的分析研究。

本研究基于前期建立的GeXP多重分析平臺，原理是在同一體系中擴增多個靶基因位點，因擴增產(chǎn)物的長度不同，可被毛細管電泳分開，達到基因分型的目的。該平臺利用96孔板、雙通道的設(shè)置，可同時檢測192個樣品；四色熒光染色、毛細管電泳分離，使分辨率達到1 bp。本研究設(shè)計在同一體系內(nèi)同時檢測2個SNP位點的4個基因型，選取MTHFR基因上2個易感位點rs1801131(A1298C)和rs1801133(C677T)。Zidan等[12]在2013年報道的病例對照研究表明，兩位點的突變等位基因攜帶型其發(fā)生先心病的幾率是對照組的2倍，且A1298C一般作為輔助，聯(lián)合C677T突變對先心病的發(fā)生起推動作用，單純A1298C突變與先心病的相關(guān)性常為陰性[4]。

本研究中，研究對象是中國北方散發(fā)兒童，共檢測了261例先心病患兒和49例健康對照兒童的血標本，2組比較其等位基因位點及其基因型多態(tài)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與本研究相似，蔣幼芳等[13]研究報道母親MTHFR 677C/T多態(tài)性與子代先心病發(fā)生未見關(guān)聯(lián)。有資料顯示在我國不同地區(qū)不同民族MTHFR基因存在明顯差異[14]，且高加索人、墨西哥等人群先心病患者與健康人群在此基因位點上的相關(guān)性報道也不統(tǒng)一[15]。可見人種、地域等差異是導(dǎo)致MTHFR基因致病性的協(xié)同因素。另外，本研究所選SNP為兩個研究最熱的位點，數(shù)量過少，不足以覆蓋整個MTHFR基因，使SNP對該基因的代表性弱；且所檢標本數(shù)量較少，對先心病人群的代表性不足，可能也是陰性結(jié)果的影響因素之一。

此外，除了遺傳因素外，環(huán)境因素也對先心病的發(fā)生起到重要影響。多因素logistic回歸將多種環(huán)境因素納入模型后發(fā)現(xiàn)母親教育程度、家庭收入、患慢性病、優(yōu)生認知得分、血清內(nèi)葉酸代謝物(Hcy)水平、異常生育史等因素都可提高先心病的發(fā)生幾率，不考慮環(huán)境因素，未觀察到母親MTHFR基因與子代先心病發(fā)生的相關(guān)性[13]。

綜上，本研究得到的無差異結(jié)果不能完全說明MTHFR基因與先心病沒有相關(guān)性，下一步工作需擴大樣本量，并將患兒的父母納入研究，將先心病患兒臨床表型歸類匯總，以探討基因型與不同臨床類型的相關(guān)性，同時尋找葉酸代謝通路上的其他關(guān)鍵基因，設(shè)計可覆蓋相關(guān)基因的若干個SNP標記，研究其與先心病發(fā)病的相關(guān)性。

1 Hoffman JI.Incidence of congenital heart disease: II.Prenatal incidence.Pediatric cardiology,1995,16:155-165.

2 Botto LD,Correa A,Erickson JD.Racial and temporal variations in the prevalence of heart defectsb.Pediatrics,2001,107:E32.

3 Clark KL,Yutzey KE,Benson DW.Transcription factors and congenital heart defects.Annu Rev Physiol,2006,68:97-121．

4 張婧.先天性心臟病病因和預(yù)防的研究進展.中國循證兒科雜志, 2012,7:231-238．

5 Soemedi R,Wilson IJ,Bentham J,et al.Contribution of global rare copy-number variants to the risk of sporadic congenital heart disease. American journal of human genetics,2012,91:489-501.

6 王樂,趙夢川,李貴霞,等.GeXP多重RT-PCR技術(shù)在兒童呼吸系統(tǒng)病毒感染病原體檢測中的應(yīng)用,2015,38:852-856.

7 Lourdes GF,Ines GG,Gloria L,et al.MTHFR polymorphisms in Puerto Rican children with isolated congenital heart disease and their mothers.Int J Genet Mol Biol,2010,2:43-47．

8 張佳,廖端芳,張旭,等.高保真DNA聚合酶在SNP檢測中的應(yīng)用.南華大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2003,31:128-133.

9 Zhu H,Yang W,Lu W,et al.Gene variants in the folate-mediated one-carbon metabolism (FOCM) pathway as risk factors for conotruncal heart defects.Am J Med Genet A,2012,158A:1124-1134.

10 閆麗盈,李勇.MTHFR C677T基因多態(tài)性與先天性心臟病的關(guān)系.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,3:448.

11 RaIf J,Stefam K,Heinrich V.Infant methyIenetetrahydrofoIate reductase677TTgenotypeis a riskfactor for congenitaI heart disease.CardiovascRes,2001,5:251-254.

12 Zidan HE,Rezk NA,Mohammed D.MTHFR C677T and A1298C gene polymorphisms and their relation to homocysteine level in Egyptian children with congenital heart diseases.Gene,2013,529:119-124.

13 蔣幼芳,梅瑾,張聞,等.母親MTHFR 677C/T多態(tài)性和孕期狀況與子代發(fā)生先天性心臟病的相關(guān)性研究.中華流行病學(xué)雜志,2015,36:1072.

14 王莉娜,周世媛.MTHFR基因突變在先天性心臟病發(fā)病機制中的研究進展.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,11:1430-1431.

15 Sahiner UM,Alanay Y,Alehan D,et al.Methylene tetrahydrofolate reductase polymorphisms and homocysteine level in heart defects.Pediatr Int,2014,56:167-172.

The investigation of correlation between MTHFR gene polymorphism and congenital heart disease by means of GeXP multiplex analysis technique

FENGZhishan*,ZHAOMengchuan,WANGLe*,etal.

*PediatricResearchInstitute,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

Objective To investigate the correlation between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene polymorphism and congenital heart disease (CHD) by means of Genomelab genetic analysis system (GeXP).Methods The peripheral blood specimens of 261 children patients with CHD who

cardiac surgical procedures in Department of Cardiac Surgery of Hebei Provincial Children Hospital from February 2013 to December 2014 were collected,moreover, the peripheral blood specimens of 49 healthy children were collected as control group. The whole blood DNA was extracted from the blood specimens,then the two sensitive loci (rs1801131 and rs1801133) in MTHFR gene were detected by GeXP multiplex analysis technique. The correlation between MTHFR gene polymorphism and congenital heart disease was analyzed and statistically tested by chi-square test (χ2) with SPSS 16.0 software.Results The GeXP gene sequencing technique could simultaneously detect four kinds of genotypes of two single nucleotide polymorphism (SNP) . There were no significant differences in MTHFR677C/T allele and genotype frequency between CHD group and control group (χ2=0.853,P=0.356;χ2=0.898,P=0.343).Conclusion GeXP multiplex analysis platform is a kind of multiplex analysis technique in screening susceptibility genes of CHD,with fine specificity and simple operation.The experimental results show that there are no significant differences in MTHFR allele or its genotype distribution between patients with CHD and healthy children,which can be used to explore susceptibility genes of CHD and establish the basis of methodology for large sample study later.

congenital heart disease; MTHFR;children

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.006

項目來源：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展支撐計劃項目(編號：13277747D)；傳染病重大專項(編號：2013ZX 10004-001，2012ZX10004-215，2013ZX10004-202，2013ZX10004804-007)

050031 石家莊市，河北省兒童醫(yī)院(馮志山、王樂、李貴霞、陶曙光、溫琳琳、王琨)；河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(趙夢川)；中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所中心實驗室(馬學(xué)軍)

李貴霞，050031 石家莊市，河北省兒童醫(yī)院；

E-mail：13832179762@139.com

R 725.411

A

1002-7386(2016)08-1143-04

2015-11-21)