李敏 李少燕 張愛國(guó) 張玉梅 苑霖 賈佩佩

·藥物研究·

HPLC-MS-MS測(cè)定犬血漿中間尼索地平含量

李敏 李少燕 張愛國(guó) 張玉梅 苑霖 賈佩佩

目的 利用HPLC-MS-MS測(cè)定Beagle犬血漿中間尼索地平的含量，并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。方法 利用Symmetry C18柱，20℃下，以乙腈-水(70∶30, v/v)為流動(dòng)相，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。采用負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 387.0→ m/z 122.0。血漿樣品采用乙腈沉淀蛋白，進(jìn)樣質(zhì)譜分析。結(jié)果 方法的最低定量下限為0.25 ng/ml；間尼索地平檢測(cè)濃度在0.25～20 ng/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9943)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Cmax為(13.86±3.12)ng/ml，Tmax為(2.6±2.25)h，t1/2為(9.37±2.74)h，ke為(1.24±0.52)×10-3，AUC0-t為(88.46±4.79)ng·h-1·ml-1，AUC0-∞為(98.35±1.89)ng·h-1·ml-1。結(jié)論 本法靈敏度高，操作方便，適合于Beagle犬血漿中間尼索地平的藥動(dòng)學(xué)研究。

間尼索地平；HPLC-MS-MS；藥動(dòng)學(xué)

高血壓是持續(xù)血壓過(guò)高的疾病，可伴有心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性改變的全身性疾病，稍有不慎會(huì)引起中風(fēng)、心臟病、血管瘤、腎衰竭等疾病，因此已引起人們的高度重視。間尼索地平(m-Nisoldipine)是新型的1，4-二氫吡啶類血管擴(kuò)張性鈣通道受體拮抗劑[1,2]，具有良好的降壓效果[3-5]。本文旨在通過(guò)優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，采用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS-MS)技術(shù)測(cè)定Beagle犬血漿中間尼索地平的含量[6-9]，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究[10-15]。

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器 Agilent 1100LC/MSD色譜系統(tǒng)API 4000型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有ESI源(美國(guó)ABI公司)；Shimadzu 20A 系統(tǒng)輸液泵：二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱(日本Shimadzu公司)；MDS Sciex Analyst software (version1.4.1，美國(guó)ABI公司)；TG16-WS型離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 藥品及方法 間-尼索地平對(duì)照品(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher化學(xué)公司)；醋酸銨(色譜純，Tedia化學(xué)公司)。6只Beagle犬(購(gòu)自上海新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng))體重7～11 kg，雌雄各半，試驗(yàn)前12 h禁食，將藥物夾在饅頭中喂食。

2 結(jié)果

2.1 溶液的配制 精密稱取間-尼索地平對(duì)照品25 mg，置25 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容配成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。

2.2 血漿樣本的制備 按體重以2.5 mg/kg劑量，使6只Beagle犬吞服夾有藥物的饅頭，分別于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、8、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)，從皮下隱靜脈取血置于肝素化離心塑料管中，分離血漿，同法取空白血漿， -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取Beagle犬血漿100 μl，依次加入300 μl乙腈(或200 μl乙腈，100 μl乙腈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液)，渦旋30 s，離心(10 000 r/min)5 min，取上清液100 μl，加200 μl水溶液，渦旋30 s，取200 μl上述溶液于進(jìn)樣器小瓶，進(jìn)樣50 μl進(jìn)行 LC-MS分析。

2.4 色譜質(zhì)譜條件的選擇 色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm；4.6 μm)，預(yù)柱同分析柱配套；20℃下，以乙腈-水(70∶30, v/v)為流動(dòng)相，進(jìn)樣量：50 μl；流速：0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。

MSD檢測(cè)條件：離子源為ESI源；噴霧電壓-4 000 V；霧化溫度500℃；霧化氣NEB 40 L/min；碰撞氣CAD為8 L/min；簾氣CUR為20 L/min；輔助氣AUX40 L/min；檢測(cè)方式為負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓為27 V；駐留時(shí)間(dwell time)為100 ms，用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 387.0→m/z 122.0。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性:間尼索地平的主要碎片離子m/z 122為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。測(cè)得Beagle犬空白血漿、空白血漿加藥及給藥后血漿樣品的典型色譜圖，間尼索地平的保留時(shí)間5.97 min。且Beagle犬空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響間尼索地平的測(cè)定。見圖1。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量下限:精密稱取“2.1”儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成一系列濃度0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、15.0、20.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述溶液100 μl，精密加入Beagle犬空白血漿100 μl，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，以間尼索地平的峰面積(A)對(duì)其濃度C(ng/ml)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=5590C+254(r=0.9943)。結(jié)果表明，間尼索地平血漿濃度在0.25～20.0 ng/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。血漿中間尼索地平的定量下限為0.25 ng/ml。

圖1 間尼索地平在Beagle犬血漿中的色譜圖

注：A：空白Beagle犬血漿；B：空白Beagle犬血漿加間尼索地平；C：Beagle犬口服間尼索地平30 min后血漿樣品

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度:分別精密吸取0.5、2.0、15.0 ng/ml 3種濃度間尼索地平標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl各3份，精密加入Beagle犬空白血漿100 μl，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，依上述質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算結(jié)果表明，3種濃度間尼索地平的準(zhǔn)確度RE、日內(nèi)及日間RSD均小于15%，符合目前生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定。

2.5.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng):分別精密吸取0.5、2.0、15.0 ng/ml 3種濃度間尼索地平標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl各3份，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，計(jì)算間尼索地平的回收率為：(101.6±1.11)%，(98.7±0.53)%，(99.7±7.21)%。血漿中3種濃度的回收率均大于80%，其相對(duì)偏差均小于10%，說(shuō)明該方法的回收率符合要求。

取間尼索地平0.5，2.0，15.0 ng/ml 3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，用流動(dòng)相代替血漿，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，記錄間尼索地平的峰面積為A1。另取Beagle犬空白血漿按“2.3”項(xiàng)下方法萃取并“N2流下吹干”后，加入3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄間尼索地平的峰面積為A2。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)ME=A2/A1×100%，ME分別為：(95.4±5.1)%，(97.5±3.1)%，(101.5±6.7)%，3種濃度間尼索地平的ME均大于80%，符合規(guī)定。

2.5.5 樣品穩(wěn)定性考察:按“2.3”項(xiàng)下方法制備0.5、2.0、15.0 ng/ml 3種濃度間尼索地平樣本各3份，考察其室溫放置24 h及在-20℃冷凍15 d，經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)后間尼索地平的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，間尼索地平在上述3種條件下均穩(wěn)定，相對(duì)誤差RE均在±10%之間，RSD<15%。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 6只Beagle犬均口服2.5 mg/kg的間尼索地平，于給藥后不同時(shí)間從后肢皮下隱靜脈取血，采用LC-MS-MS測(cè)得各樣品中間尼索地平的濃度，根據(jù)藥-時(shí)曲線，采用梯形法計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。見表1、見圖2。

表1 Beagle犬按2.5 mg/kg劑量口服間-尼索地平藥動(dòng)學(xué)參數(shù) n=6

圖2 Beagle犬服用間-尼索地平后藥-時(shí)曲線

3 討論

3.1 目前，我國(guó)高血壓患者達(dá)1億人之多，并有繼續(xù)上升的趨勢(shì)，已成為臨床常見病和引發(fā)心腦血管并發(fā)癥最嚴(yán)重的疾病之一，而有效抗高血壓藥物治療可以預(yù)防由高血壓引起的腦血管意外、心功能衰竭和腎功能不全，并明顯降低其病死率。鈣拮抗劑(Calcium antagonists)是目前治療高血壓和心絞痛的主要藥物。其中二氫吡啶類鈣拮抗劑(DHP-CaA)特異性高、作用強(qiáng)，發(fā)展迅速，現(xiàn)已上市的藥物已達(dá)十幾種，臨床效果良好，大都成為心血管系統(tǒng)疾病的一線用藥，同時(shí)與其他類型的降壓藥可聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)療效，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

因此，間尼索地平作為新型的二氫吡啶類鈣拮抗劑[3-5]，對(duì)其進(jìn)行全面的藥動(dòng)學(xué)研究刻不容緩，以便為該藥的申報(bào)及上市后生產(chǎn)及使用提供全面的保障。

3.2 間尼索地平為新型的二氫吡啶類鈣拮抗劑，迄今尚未見到利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定間尼索地平在Beagle犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化色譜條件，首次建立了用LC-MS-MS法測(cè)定Beagle犬血漿中間尼索地平血藥濃度的方法。并進(jìn)一步研究了Beagle犬口服給藥后間尼索地平在其體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，獲得了可靠的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。新藥的全方位研究可加強(qiáng)新藥研發(fā)過(guò)程中對(duì)化合物的生理活性和生物利用度的確認(rèn)，給藥途徑、劑型選擇及相應(yīng)工藝的優(yōu)化，從而全面提高藥物質(zhì)量和穩(wěn)定性，為新藥的研制與開發(fā)提供試驗(yàn)根據(jù)。

3.3 本文通過(guò)LC-MS-MS對(duì)間尼索地平在Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，由于該藥在生物樣品中的血藥濃度相對(duì)較低[16,17]，故采用簡(jiǎn)單的沉淀蛋白法處理樣品，避免了二氫吡啶類生物樣品經(jīng)常采用的液-液萃取的冗繁操作，減少樣品處理過(guò)程帶來(lái)的不必要的損失。

3.4 本研究對(duì)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇進(jìn)行多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)考察過(guò)多項(xiàng)物質(zhì)，主要涉及到氯硝西泮、地西泮、尼莫地平、芍藥苷、曲克蘆丁、梔子苷和吲達(dá)帕胺等。由于色譜質(zhì)譜條件、內(nèi)源性物質(zhì)干擾以及質(zhì)譜負(fù)離子檢測(cè)等多方面的局限性，未能找到合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；經(jīng)過(guò)對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行研究，采用乙腈沉淀蛋白進(jìn)行樣品前處理，操作簡(jiǎn)便，誤差因素較少，且間尼索地平的質(zhì)譜響應(yīng)變異較小，經(jīng)過(guò)考證分析方法的可行性，最終本法專屬性、線性范圍和線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度均能夠滿足生物樣品測(cè)定的要求，故犬血漿中間尼索地平的含量測(cè)定采用外標(biāo)法進(jìn)行。

3.5 生物樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析的前提條件是選擇合適的離子化檢測(cè)模式。本研究通過(guò)優(yōu)化MSD參數(shù)以獲得足夠豐度的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正離子檢測(cè)模式下，采用ESI或APCI離子化源，間尼索地平的測(cè)定方法均不能獲得較高的靈敏度，而在負(fù)離子模式下采用ESI源，實(shí)驗(yàn)方法不僅有較高的靈敏度而且重現(xiàn)性也很好。同時(shí)，對(duì)液相色譜條件也進(jìn)行了優(yōu)化，在20℃下，色譜柱采用C18柱(150 mm×4.6 mm；4.6 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(70 ∶30, v/v)，流速為0.8 ml/min，進(jìn)樣量50 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。

3.6 本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定Beagle犬血漿中間尼索地平的含量，方法精密度和準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單快速、專屬性好，為該類藥物研究方法的建立以及藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，為間尼索地平消旋體的研制與開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為高血壓患者的治療提供新的藥物，使高血壓病人能夠用到安全有效的藥物。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.046

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20130069)

063000 河北省唐山市，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部(李敏、李少燕、張愛國(guó)、張玉梅)；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(苑霖、賈佩佩)

R 927.2

A

1002-7386(2016)08-1259-03

2015-11-01)