馮剛，李世瑋，李暉

(1 錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000；2 上海健康醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院東院)

依那西普滴眼液用于小鼠干眼癥的效果及其機制

馮剛1，李世瑋2，李暉2

(1 錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000；2 上海健康醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院東院)

目的 觀察依那西普滴眼液用于小鼠干眼癥的效果，并探討其作用機制。方法 將苯扎氯銨溶液誘導的30只干眼癥小鼠隨機分為干眼組、PBS組、依那西普組，每組10只。干眼組不予任何處理，PBS組、依那西普組分別給予PBS、0.1%依那西普滴眼液滴眼，連用14天。滴眼前(第0天)及滴眼第7、14天檢測淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜熒光素鈉染色評分(角膜染色評分)。滴眼第14天處死小鼠，檢測結膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α表達。結果 各組滴眼前淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜染色評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與滴眼前比較，依那西普組滴眼第7、14天淚液分泌量增加、淚膜破裂時間明顯延長，角膜染色評分明顯降低(P均<0.05)，干眼組各指標變化不明顯(P均>0.05)；與PBS組、干眼組滴眼第7、14天比較，依那西普組同時間點淚液分泌量增加、淚膜破裂時間明顯延長，角膜染色評分明顯降低(P均<0.05)，而PBS組、干眼組同期上述各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。滴眼第14天，依那西普組結膜組織上清液炎癥因子IL-1β、IL-17和TNF-α水平明顯低于干眼組(P均<0.05)，而PBS組、干眼組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論 依那西普滴眼液可減輕苯扎氯銨誘導的干眼癥小鼠的臨床癥狀，其機制可能與抑制IL-1β、IL-17、TNF-α等炎癥因子水平有關。

干眼癥；依那西普；炎癥因子；小鼠

干眼癥是指任何原因造成的淚液質或量異常，或淚液的動力學異常，導致淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特征的多種疾病的總稱[1]。主要表現為眼睛干澀，有異物感、癢感、燒灼感，并有畏光、眼部充血、視物模糊、易疲勞等。目前對干眼癥的常規(guī)治療是人工淚液滴眼，但僅能緩解癥狀。已有研究證實，炎癥因子(如TNF-α、IL-1等)可參與眼部多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。在某些眼部炎癥性疾病，如難治性葡萄膜炎、鞏膜炎、周邊潰瘍性角膜炎等，全身應用TNF-α抑制劑治療效果較好[2,3]。但全身應用TNF-α抑制劑對干眼癥的效果尚不一致[4～6]。鑒于TNF-α在干眼癥動物結膜組織中高表達，我們推測局部應用TNF-α抑制劑可改善干眼癥狀，并避免全身用藥引起的肝腎損傷等。2015年9～12月，我們觀察了TNF-α抑制劑依那西普滴眼液對苯扎氯銨誘導的小鼠干眼癥的治療效果?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性BALB/c小鼠50只，8周齡，體質量(18±3)g，由錦州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK(遼)2014-0010。常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(25±1)℃，相對濕度40%，模擬燈光晝夜更替(9：00～21：00)。主要儀器及試劑：S350S型裂隙燈顯微鏡，上海美沃精密儀器有限公司；酚紅棉線，日本Yokota公司；722型可見光分光光度計，上海光學儀器一廠；苯扎氯銨粉末，上海瑞齊生物科技有限公司；PBS，美國Gibco公司；依那西IFN-γ普，輝瑞制藥有限公司；戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；熒光素鈉溶液，廣西梧州制藥(集團)股份有限公司；小鼠IL-17、TNF-α ELISA試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司；小鼠IL-1β ELISA試劑盒，上海逸峰生物科技有限公司。

1.2 干眼模型制備 所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周制備干眼癥模型：每日8：00、18：00給予0.2%苯扎氯銨溶液5 μL(0.2 g苯扎氯銨粉末溶于99.8 mL去離子水)滴眼，連用14天。第15天評估干眼情況，記錄淚液分泌量，取最接近均數的30只小鼠納入后續(xù)實驗。

1.3 動物分組及藥物干預 選取干眼小鼠30只，隨機分為干眼組、PBS組、依那西普組，每組10只。PBS組次日開始給予PBS 2 μL滴眼，依那西普組給予0.1%依那西普滴眼液(依那西普25 mg加入25 mL PBS中)2 μL滴眼，6 h滴眼1次，連用14天。干眼組不予任何處理。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜熒光素鈉染色評分(角膜染色評分) 淚液分泌量：滴眼前(第0天)及滴眼第7、14天當日15：00，腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg全身麻醉后拉開下瞼，用眼科顯微鑷夾持酚紅棉線，將其置于下結膜囊中外1/3處，停留60 s取出。顯微鏡下讀取濕潤變紅的酚紅棉線長度(mm)。淚膜破裂時間：淚液分泌量檢測后用玻璃棒蘸取1%熒光素鈉溶液1 μL，滴入結膜囊內，手動瞬目3次，扒開瞼裂，裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察。秒表計時，記錄最后一次瞬目到角膜第1個黑斑出現的時間。重復3次，取平均值。角膜染色評分：上述熒光素鈉滴入90 s時，裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察角膜上皮熒光素鈉染色情況。參照Lemp等[7]評分標準：0分為無著染；1分為點狀著染；2分為斑塊狀著染，并有部分融合區(qū)；3分為大量融合的斑塊狀著染或片狀著染。角膜分為中央區(qū)、鼻側區(qū)、顳側區(qū)、上區(qū)、下區(qū)，5個區(qū)得分相加即為染色評分。最低0分，最高15分。得分越高表示干眼癥越嚴重。

1.4.2 結膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平 滴眼第14天，所有動物斷頭處死，立即摘除眼球，取下結膜組織，置于含蛋白酶抑制劑的裂解液中30 min，以3 000～4 000 r/min離心15 min，收集上清，儲存于-70 ℃，備測。采用雙抗體夾心ELISA法檢測結膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α，所有操作嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組淚液分泌量、淚膜破裂時間、角膜染色評分比較 見表1。

表1 各組淚液分泌量、淚膜破裂時間、角膜染色評分比較

注：與同組第0天比較，*P<0.05；與同組第7天比較，△P<0.05；與干眼組同時間比較，#P<0.05；與PBS組同時間比較，▲P<0.05。

2.2 各組結膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平比較 見表2。

表2 各組結膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平比較

注：與干眼組比較，*P<0.05；與PBS組比較，#P<0.05。

3 討論

苯扎氯銨滴眼可以造成小鼠淚液分泌量減少，淚膜破裂時間縮短，眼表上皮損傷以及角膜上皮鱗狀化生、杯狀細胞減少等眼表結構功能的變化，是一種較好的干眼動物模型制作方法[7]。近年研究表明，免疫性炎癥可能在干眼癥的發(fā)病中具有重要作用，特別是美國FDA批準了免疫制劑——環(huán)孢素A可用于干眼癥的治療，使免疫制劑在干眼癥的研究中越來越受到關注。TNF-α是眾多免疫性炎癥因子之一，多種自身免疫性炎性疾病可通過抑制內源性TNF-α的產生來進行治療。研究發(fā)現，膠原誘導的關節(jié)炎小鼠全身應用TNF-α抑制劑可增加淋巴結內Th1、Th17細胞數量，減輕關節(jié)炎癥狀[8]；抗TNF-α抗體可用于炎癥性腸道疾病和銀屑病等自身免疫性疾病的治療[9，10]；TNF-α是干眼癥患者淚液中主要的炎癥因子之一[11～13]，TNF-α及其受體在干眼癥的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用[14]。但關于TNF-α抑制劑全身用藥對實驗性及臨床干眼癥患者的效果尚存爭議。Zhu等[15]在兔干眼模型中發(fā)現，TNF-α抑制基因轉染可抑制干眼癥的癥狀。而Vosters等[8]研究發(fā)現，TNF-α抑制劑對干眼癥小鼠的治療效果一般。臨床研究也發(fā)現，口服或皮下注射TNF-α抑制劑對干眼癥患者的療效并不一致[4,6]。而局部應用TNF-α抑制劑治療干眼癥的研究鮮見報道。局部應用TNF-α抑制劑與全身用藥相比，可避免全身用藥的局部注射斑塊、疼痛、靶器官藥物濃度無法精準控制等缺點。本研究通過局部應用TNF-α抑制劑——依那西普，觀察了依那西普滴眼液局部應用對干眼癥的臨床效果。

依那西普可通過拮抗TNF-α的功能，從而抑制炎癥反應。本研究結果顯示，各組滴眼前淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜染色評分比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明三組動物的干眼癥病情基本一致，后續(xù)結果的差異主要來自于用藥的不同。與滴眼前相比，依那西普組滴眼第7、14天淚液分泌量增加、淚膜破裂時間明顯延長、角膜染色評分明顯降低，PBS組、干眼組各指標變化不明顯；與PBS組、干眼組滴眼第7、14天比較，依那西普組滴眼同期淚液分泌量增加、淚膜破裂時間明顯延長、角膜染色評分明顯降低，而PBS組、干眼組同期上述各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義。滴眼第14天，依那西普組結膜組織上清液炎癥因子IL-1β、IL-17和TNF-α水平均明顯低于PBS組、干眼組，而PBS組、干眼組比較差異均無統(tǒng)計學意義。表明依那西普滴眼液可改善苯扎氯銨誘導的干眼癥小鼠的臨床癥狀。局部應用TNF-α抑制劑可直接作用于炎性眼表，效果好于全身用藥[14,16]。而干眼組、PBS組淚液分泌量、淚膜破裂時間、角膜染色評分及結膜組織中炎癥因子在用藥前后并無明顯變化。表明PBS對干眼癥狀無緩解或改善作用。

依那西普制成滴眼液局部應用與以往全身用藥對干眼癥的作用差異可能與以下幾個方面有關：①干眼模型的差異。既往全身應用TNF-α抑制劑的研究中，應用的是自身免疫性疾病干燥綜合癥動物模型或患者[4，6，8，15]。干燥綜合征是一個主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫性疾病，雖然干燥綜合癥與干眼癥的臨床表現有部分重合，但干燥綜合癥還伴有除淚腺以外的其他外分泌腺功能障礙。因此，干燥綜合癥與干眼癥病理機制、臨床表現等各方面的差異可能是造成本文與既往研究結果存在差異的原因。②用藥方式的不同。本研究采用依那西普滴眼液局部用藥，既往研究多采用全身用藥，全身用藥導致靶器官的藥物濃度無法精確控制，而依那西普的不同濃度對炎癥的作用并不相同，因此不排除全身用藥后眼結膜局部的依那西普濃度與本研究0.1%依那西普的濃度差異導致結果的差異[17]。

分析本研究結果，依那西普滴眼液可改善干眼癥的臨床癥狀，其機制可能與抑制TNF-α及其他炎癥因子水平有關。但本研究觀察時間較短，其長期療效還需進一步觀察，且用于臨床還需要臨床病例進行驗證。

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上海健康醫(yī)學院種子基金項目(HMSF-16-21-013)。

李暉(E-mail： lky0110@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.012

R777

A

1002-266X(2016)24-0037-03

2016-04-20)