趙玥明，滿朝新，曲艷艷，姜　霞，姜毓君，(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　50030;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱　50086)

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環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌

趙玥明1，滿朝新2，曲艷艷1，姜霞1，姜毓君1，2
(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030;2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150086)

摘要:應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)建立了對(duì)肉中金黃色葡萄球菌檢測(cè)的方法。實(shí)驗(yàn)中，使用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶完成LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，并針對(duì)金黃色葡萄球菌所特有的保守性耐熱核酸酶基因(nuc)設(shè)計(jì)得到了一套LAMP擴(kuò)增引物。對(duì)LAMP法和PCR法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較，同時(shí)對(duì)人工污染肉中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:所建立的LAMP法能夠特異性的檢測(cè)金黃色葡萄球菌，并且檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度為2.01×100CFU/mL，是普通PCR檢測(cè)靈敏度的100倍。在檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌時(shí)，檢測(cè)限為2.01×101CFU/mL。因此，本實(shí)驗(yàn)所建立的LAMP法檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌的方法，具有靈敏、快速以及簡(jiǎn)便等的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有很好的發(fā)展前景的檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;金黃色葡萄球菌;肉

常見(jiàn)的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單核增生性李斯特菌等，其中金黃色葡萄球菌是一類在人類和動(dòng)物中常見(jiàn)的病原體［1］，可以引起皮膚和軟組織感染、敗血癥、骨髓炎和肺炎等疾?。?，3］。該菌種通過(guò)傳染及毒素介導(dǎo)而導(dǎo)致食物中毒［2］。有文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了金黃色葡萄球菌在肉、牛奶以及奶酪等食品中導(dǎo)致了食源性疾病的暴發(fā)［4-6］，因而檢測(cè)肉中的金黃色葡萄球菌方法的建立有著很重要的作用。

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在各個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域［7］。目前針對(duì)食源性致病菌的快速檢測(cè)方法，主要集中在PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、ELISA法、生物傳感器技術(shù)等，但都存在著一定程度上的不足［8］。例如，PCR技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于檢測(cè)多種致病菌，但是PCR技術(shù)需要昂貴的熱循環(huán)儀器，經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員并且需要擴(kuò)增幾個(gè)小時(shí)［9］。為了克服PCR技術(shù)的不足，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，在60～65℃之間進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增［10］。該擴(kuò)增反應(yīng)通過(guò)自主序列復(fù)制和鏈置換的擴(kuò)增方式，使得擴(kuò)增產(chǎn)物形成類似花椰菜結(jié)構(gòu)，電泳時(shí)呈現(xiàn)出階梯式圖譜，在1h內(nèi)完成反應(yīng)，因此縮減了檢測(cè)時(shí)間，并且LAMP反應(yīng)可在水浴鍋中進(jìn)行，極大的降低實(shí)驗(yàn)成本［11］。因此，該方法具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便等的特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用最新研發(fā)出來(lái)的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進(jìn)行LAMP反應(yīng)體系的構(gòu)建，使得較之前的大片段DNA聚合酶所構(gòu)建的LAMP反應(yīng)［9，12，13］，該酶在2012年首次得以應(yīng)用［14］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該酶具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如，可以提高反應(yīng)速率，提高持續(xù)的合成能力，較普通的Bst大片段DNA聚合酶具有更好的熱穩(wěn)定性［14-16］。本實(shí)驗(yàn)所建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌的方法，達(dá)到了更為穩(wěn)定、快速、特異、靈敏的檢測(cè)目的，具有更好的應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1。

Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，New England Biolabs;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及Taq PCR Master-Mix，北京天根生物技術(shù)有限公司;甜菜堿(Betaine)，美國(guó)Sigma公司; dNTP，北京天根生物技術(shù)有限公司; DNA marker，北京百泰克生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖，西班牙Biowest公司; Tc-25/H型基因擴(kuò)增儀，美國(guó)PCR Kin Elmer Gene Amp; DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠; UVP凝膠成像儀，美國(guó)UVP公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同菌種的培養(yǎng)以及DNA模板的提取取金黃色葡萄球菌ATCC13565作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，3株金黃色葡萄球菌(ATCC25923、CMCC26074、CMCC26075)作為參考菌株以及其他25株非金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。金黃色葡萄球菌及其他菌種，分別活化培養(yǎng)于NB以及復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。分別吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液1mL，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，將所得到的DNA模板于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　實(shí)驗(yàn)所用菌株及來(lái)源

1.2.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成在GenBank中尋找到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)，該基因具有特異性好的特點(diǎn)，并且具有高度的保守性。因此，本文應(yīng)用此特異性基因nuc序列進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)［50，81］。采用在線的Primer Explorer4.0引物設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)特異性的目的片段設(shè)計(jì)得到了一套特異性引物，如表2所示。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)體系(25μL)包括:內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、MgCl2、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、DNA模板、10×Buffer、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，滅菌水補(bǔ)足體系。將混合物在65℃恒溫60min進(jìn)行擴(kuò)增，之后將體系加熱到80℃持續(xù)5min以終止反應(yīng)。選擇對(duì)LAMP體系中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，包括鎂離子濃度(2、4、6、8、10mmol/L)、dNTP濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2mmol/L)、外引物與內(nèi)引物濃度比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)、甜菜堿濃度(0、0.4、0.8、1.2、1.6mol/L)、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μL)，根據(jù)LAMP擴(kuò)增后電泳圖條帶的有無(wú)和亮度選擇最適條件，建立LAMP反應(yīng)體系。

表2　金黃色葡萄球菌nuc基因LAMP引物序列

建立LAMP反應(yīng)體系后，將反應(yīng)體系分別在61℃、62℃、63℃、64℃及65℃條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，確定最適反應(yīng)溫度。并在確認(rèn)的最適反應(yīng)溫度下，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，分別擴(kuò)增15、30、45、60、75min，擴(kuò)增后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，確定LAMP反應(yīng)的最適反應(yīng)條件。

1.2.4 LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異性按照1.2.1的方法，提取4株金黃色葡萄球菌以及其他26株非金黃色葡萄球菌的DNA，分別作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 LAMP及PCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度的比較應(yīng)用平板計(jì)數(shù)法得到初始菌液濃度為2.01× 109CFU/mL。取1mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)液，用0.85%生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。用試劑盒對(duì)不同濃度的金黃色葡萄球菌菌液提取基因組DNA，并作為模板分別進(jìn)行PCR和LAMP反應(yīng)。分別取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

建立PCR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的反應(yīng)體系為25μL: 12.5μL of Taq PCR MasterMix，1μL F3以及1μL B3，2μL模板DNA，用蒸餾水補(bǔ)足體系至25μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察擴(kuò)增效果。

1.2.6 LAMP檢測(cè)人工污染肉中金黃色葡萄球菌購(gòu)買(mǎi)鮮肉25g，經(jīng)國(guó)標(biāo)法確認(rèn)肉中不含金黃色葡萄球菌。按照國(guó)標(biāo)法GB 4789.10—2010，將所購(gòu)買(mǎi)的25g鮮肉放入含有225mL BPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，混勻后每25mL為1組，分裝10組，分別添加109～100CFU/mL不同濃度的金黃色葡萄球菌2.5mL，制成金黃色葡萄球菌濃度為108～10－1CFU/mL的人工污染肉漿，應(yīng)用試劑盒提取每組中的金黃色葡萄球菌DNA作為模板，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

2　結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確立了最終LAMP反應(yīng)體系為: 0.4mmol/L的F3及B3，2.4mmol/L的FIP和BIP，4mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，0.4mol/L甜菜堿，0.9μL的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8U)，2.5μL 10×Buffer及2μL模板。最佳反應(yīng)條件為:在64℃條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13 565采用優(yōu)化的LAMP體系擴(kuò)增60min。擴(kuò)增后電泳結(jié)果如圖1，陽(yáng)性組呈現(xiàn)出LAMP產(chǎn)物所特有的梯狀條帶，而以滅菌水為模板的空白組，則未出現(xiàn)梯狀條帶。

圖1　金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)結(jié)果

2.2 LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異性

4株金黃色葡萄球菌為模板的泳道均有LAMP特異性的條帶產(chǎn)生，而其他26株非金黃色葡萄球菌均呈陰性，無(wú)特異性的梯形條帶。結(jié)果如圖2所示。

2.3 LAMP及PCR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度的比較

原始金黃色葡萄球菌菌液濃度為2.01×109CFU/mL，從圖3可知，2.01×109～2.01×100CFU/mL都有典型的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的梯形條帶，而2.01×10－1CFU/mL未見(jiàn)LAMP擴(kuò)增。由此可見(jiàn)，LAMP方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度為2.01×100CFU/mL。對(duì)比圖4可知，PCR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度是2.01× 102CFU/mL。通過(guò)比較可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的LAMP法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的檢出限是PCR法的100倍。

圖2　 LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度電泳圖

圖3　 PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度電泳圖

2.4 LAMP檢測(cè)人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的靈敏度

如1.2.6中所示，人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的濃度為2.01×108～2.01×10－1CFU/mL，分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，LAMP法檢測(cè)人工污染肉漿中金黃色葡萄球菌的檢出限為2.01×101CFU/mL (圖4)。

圖4　 LAMP檢測(cè)人工污染肉中金黃色葡萄球菌的靈敏度電泳圖

3　討論

目前，基于核酸擴(kuò)增檢測(cè)食源性致病菌的方法已得到了飛速的發(fā)展。針對(duì)于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，主要圍繞著傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定相結(jié)合的方法、PCR法以及熒光定量PCR法［17-19］。近幾年已有應(yīng)用Bst大片段DNA聚合酶進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)金黃色葡萄球菌，但都未從肉基質(zhì)中進(jìn)行檢測(cè)［19］。而本文應(yīng)用了Biolab公司最新研發(fā)出的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。該酶較傳統(tǒng)的Bst大片段DNA聚合酶的優(yōu)點(diǎn)在于，該酶是熱啟動(dòng)酶，無(wú)需低溫條件下配制反應(yīng)體系，即可保證酶催化反應(yīng)的特異性，從而使反應(yīng)更適合于現(xiàn)場(chǎng)的食源性致病菌檢測(cè)，為該方法的實(shí)際應(yīng)用創(chuàng)造了更大的可能。經(jīng)比較得知傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)檢測(cè)方法需要5d左右，PCR及熒光定量PCR法需要3～4h，LAMP方法只需1h即可擴(kuò)增109倍從而達(dá)到檢測(cè)目的［10］。同時(shí)，也有報(bào)道稱LAMP反應(yīng)不易受食品基質(zhì)中成分的抑制作用，對(duì)DNA模板純度要求不高［20］。因此可知，LAMP檢測(cè)方法具有快速、特異、靈敏等的優(yōu)點(diǎn)。然而，正因?yàn)長(zhǎng)AMP方法的高靈敏性，導(dǎo)致了該方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性的污染問(wèn)題。因此，要特別注意實(shí)驗(yàn)的分區(qū)操作，從而防止假陽(yáng)性的產(chǎn)生。此外，LAMP檢測(cè)方法所具有的高特異性，是由于該方法識(shí)別了目的片段的6個(gè)區(qū)域，需要設(shè)計(jì)4條特異性引物，因而導(dǎo)致了反應(yīng)復(fù)雜因素增多。

本研究應(yīng)用了最新的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶建立了LAMP技術(shù)檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌的方法。由于該方法具有靈敏、快速以及簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，使得該方法為基層檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路，具有很好的發(fā)展前景，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域有望得到廣泛的應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Raw
Meat Samples by Loop-mediated Isothermal Amplification

ZHAO Yue-ming1，MAN Chao-xin2，QU Yan-yan1，JIANG Xia1，JIANG Yu-jun1，2
(1Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

Abstract:We established a method to detect Staphylococcus aureus in meat by loop-mediated isothermal amplification.During the experiment，using the latest Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase to finish the LAMP amplification reaction，and against S.aureus-specific nuclease resistant conserved gene (nuc) designed LAMP amplification primers.the detection sensitivity of LAMP and the PCR method were compured，while was detect Staphylococcus aureus.the artificially contaminated meat The results showed that the built LAMP method could specifically detect Staphylococcus aureus，and Staphylococcus aureus bacteria in pure sensitivity 2.01×100CFU / mL，which was 100 times the normal PCR detection sensitivity.the detection limit of detecting Staphylococcus aureus in meat was 2.01×101CFU / mL.Thus，the LAMP method to detect Staphylococcus aureus in meat was established，which had the advantage of sensitive，rapid and simple，which was a kind of good prospects for development of testing methods．

Keywords:loop-mediated isothermal amplification; Salmonella aureas; meat

通訊作者:姜毓君(1971—)，男，博士，教授，研究方向:食品科學(xué)。

作者簡(jiǎn)介:趙玥明(1990—)，女，在讀博士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(項(xiàng)目編號(hào): 2012BAD28B02、2013BAD18B11、2012BAD29B07)。