任香怡 胡勇 魏江平 付文君 徐世軍?┩跤姥?

[摘要]考察通絡醒腦泡騰片對多發(fā)腦梗死性癡呆（multiinfarct dementia，MID）模型大鼠血液流變學，iNOS，VEGF及LDH5影響。采用微血栓栓塞法制備MID大鼠模型，將造模成功大鼠50只隨機分為模型對照組，甲磺酸雙氫麥角毒堿片（喜得鎮(zhèn)）組（07 mg·kg-1），通絡醒腦泡騰片高、中、低劑量組（756，378，159 g·kg-1），另取10只假手術動物作為平行對照組，連續(xù)灌胃90 d。運用Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力；腹主動脈取血測定不同切變率下的全血黏度和紅細胞聚集指數(shù)；采用ELISA法測定血清iNOS和VEGF的含量；采用免疫組化和圖像分析技術測定MID大鼠海馬LDH5的表達。結(jié)果顯示通絡醒腦泡騰片能明顯縮短MID模型大鼠的逃避潛伏期，增加逃逸平臺進入次數(shù)，延長中環(huán)滯留時間，在1，5，30，200 S-14個切變率下，也能顯著降低模型大鼠的全血黏度，紅細胞聚集指數(shù)以及血清iNOS，VEGF含量和LDH5平均光密度，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義（P<005）。結(jié)果表明通絡醒腦泡騰片能提高MID模型大鼠學習記憶能力，改善外周血液流變學，降低iNOS，VEGF的含量及海馬LDH5表達，進而改善腦組織能量供應。

[關鍵詞]通絡醒腦泡騰片；多發(fā)腦梗死性癡呆；血液流變學；VEGF；iNOS；LDH5

多發(fā)腦梗死性癡呆（multiinfarct dementia，MID）是因血栓或栓塞性腦血管病引起閉塞，累及腦部重要功能區(qū)域?qū)е抡J知功能障礙的臨床綜合征[1]。MID作為血管性癡呆最主要的類型[23]，研究發(fā)現(xiàn)其多發(fā)梗塞灶形成與缺血后生化代謝[4]、血液流變學[5]異常密切相關，可通過影響炎癥反應、血管新生、側(cè)枝重建等代謝調(diào)控MID的病理進程。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）[67]和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[89]作為腦缺血時腦內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，其表達能反映腦供血狀態(tài)與血管功能，乳酸脫氫酶5（lactate dehydrogenase5，LDH5）作為糖酵解的關鍵酶，其活性變化是缺血性梗死是否進行性加重的判定指標[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通絡醒腦泡騰片能促進突觸素重塑[11]和胰島素降解酶[12]表達，改善Aβ2535所致的神經(jīng)功能障礙，也能調(diào)控Na+K+ATP酶[13]與CCO酶[14]改善慢性缺血損傷引起的腦能量代謝障礙，進而提高學習記憶能力。為進一步探討通絡醒腦泡騰片抗癡呆的可能作用機制，本文從血液流變學及血管功能角度研究其對微血栓栓塞致MID大鼠模型全血黏度，紅細胞聚集指數(shù)，iNOS，VEGF及LDH5的影響。

1材料

11儀器WMT100Morris水迷宮、Y迷宮，成都泰盟科技有限公司；SA6000自動血流變測試儀，北京賽科希德科技發(fā)展有限公司；酶標儀，Thermo公司，型號Multiskan MK3；2015型轉(zhuǎn)輪式切片機，德國徠卡（Leica）儀器有限公司；TSJⅡ型全自動封閉式組織脫水機和PHYⅢ型病理組織漂烘儀，常州市中威醫(yī)療儀器有限公司；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；ImagePro Plus 60 圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics公司。

12藥物與試劑通絡醒腦泡騰片（規(guī)格12 g/片，45 g原生藥/片），四川同道堂藥業(yè)集團股份有限公司，批號20140215；甲磺酸雙氫麥角毒堿片（喜得鎮(zhèn)），天津華津制藥有限公司，批號3H878T；血流變專用清洗液SAW，北京賽科希德科技發(fā)展有限公司，批號SAW20131201；加樣清洗維護液SAWZ，北京賽科希德科技發(fā)展有限公司，批號SAWZ2014 0101；大鼠一氧化氮合酶（NOS）ELISA Kit，英國ABBEXA公司，貨號abx53065；大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA Kit，英國ABBEXA公司，貨號abx54630；乳酸脫氫酶抗體（LDH5）兔多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司，批號bs1810R。

13動物SD大鼠（SPF級），全雄，體重280～320 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證SCXK（川）201324，實驗場地為國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學中藥藥理三級實驗室，編號TCM2032043。大鼠均在室溫22～24 ℃，明暗周期12 h/12 h條件下，自由飲水攝食。

2方法與結(jié)果

取健康SPF級SD大鼠，全雄，適應性喂養(yǎng)3 d后，Morris水迷宮實驗篩選學習記憶良好者用于造模。按照文獻[15]制備造模血栓，采用微血栓栓塞法制備MID大鼠模型[1]。假手術組動物僅注射生理鹽水，其余步驟與模型動物相同。手術后動物連續(xù)3 d肌肉注射硫酸慶大霉素注射液每只03 mL。大鼠術后恢復10 d后，進行“Y”迷宮測試[16]，評判手術對大鼠造成學習記憶損害，并篩選造模成功的大鼠50只，隨機分為5組，即模型對照組，喜得鎮(zhèn)組，通絡醒腦泡騰片高、中、低劑量組，每組10只，另取10只假手術組大鼠為平行對照。分組及給藥劑量見表1，假手術和模型對照組給予等體積生理鹽水（001 mL·g-1），其余各組灌胃給予的相應藥物每天1次，連續(xù)90 d。給藥第86天開始水迷宮訓練，第90天進行定向航行和空間探索測定，結(jié)果見表1，2。行為學測試完成后麻醉大鼠，腹主動脈取血，全自動血流變測試儀測定全血黏度和紅細胞聚集指數(shù)；分離制備血清測定iNOS和VEGF含量，結(jié)果見表3，4。處死大鼠，無菌條件下快速分離海馬，置于4%多聚甲醛中進行常規(guī)固定制片，切片，采用SP法進行免疫組織化學反應，具體方法參照說明書進行。采用 ImagePro Plus 60 圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析并測定平均光密度（IA），結(jié)果見圖1。

由表1可知，定向航行實驗訓練第1 天，各組之間的逃避潛伏期無顯著差異；與模型對照組比較，訓練第3天，通絡醒腦低劑量組的逃避潛伏期顯著縮短（P<005）；訓練第5 天，通絡醒腦高、中、低劑量組的逃避潛伏期均顯著縮短（P<005）。隨著訓練天數(shù)的延長，給藥組均表現(xiàn)出不同程度上逃避潛伏期的縮短。

由表2可知，與假手術組比較，模型對照組大鼠逃逸平臺進入次數(shù)顯著減少，中環(huán)滯留時間顯著縮短（P<005）；與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片組上述指標均明顯增多或延長，尤以中低劑量組的程度最為明顯（P<005）。

由表3 可知，與假手術組比較，模型對照組紅細胞聚集指數(shù)升高，同時在1，5，30，200 S-14個切變率下全血黏度升高，給藥后通絡醒腦高、中、低劑量組均能顯著降低全血黏度與紅細胞聚集指數(shù)（P<005）。

由表4可知，與假手術組比較，模型對照組血清iNOS和VEGF含量顯著增高（P<005）；與模型對照組比較，通絡醒腦高、中、低劑量組血清iNOS和VEGF含量顯著降低。

由圖1可知，LDH5主要表達于細胞漿、細胞膜，或間質(zhì)，陽性表達呈淺黃色或棕黃色；與假手術組比較，模型對照組海馬LDH5顯著高表達，平均

光密度值顯著增高（P<005）；與模型對照組比較，通絡醒腦泡騰片高、中劑量組LDH5表達顯著低表達，平均光密度值顯著降低（P<005）。

3討論

生化代謝異常[5]、血液流變學異常[6， 1718]是腦缺血后小梗塞灶或微梗塞形成的重要體現(xiàn)，與MID病理發(fā)展密切相關。腦缺血后，血黏度[19]與紅細胞聚集指數(shù)升高導致血流減慢，氧和營養(yǎng)轉(zhuǎn)運障礙，引起腦組織缺氧。腦組織缺氧可直接增加LDH5活性催化還原產(chǎn)生乳酸以恢復代償期腦損傷后神經(jīng)元的功能[10]，另外乳酸還可直接刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生VEGF[20]。高表達的VEGF可通過促進新生血管生成、側(cè)枝循環(huán)重建恢復血流供應；調(diào)控AKT3表達影響線粒體能量代謝[21]；或通過旁分泌作用于內(nèi)皮細胞釋放NO[22]負反饋調(diào)節(jié)VEGF。隨著缺血缺氧的過度加重，血液流變學異常，乳酸堆積過量[23]引起VEGF異常升高，血管壁順應性降低；繼而NO調(diào)節(jié)失控導致血管功能障礙，影響葡萄糖向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運最終造成或加劇MID的腦能量代謝障礙。因此生理狀態(tài)下血液流變學、LDH5活性大小與VEGF，NO之間的相互調(diào)控保證了正常的血管功能與腦能量代謝供應。而iNOS作為腦缺血后期NO合成的主要限速酶，主導了遲發(fā)性進行性腦神經(jīng)元損傷[24]，其活性高低反映了腦梗塞損害的程度[25]。腦長期缺血，細胞外刺激物例如LPS[26]激活不同的信號通路[2728]可誘導iNOS表達，引起NO過度表達，進而調(diào)節(jié)自噬通路——蛋白質(zhì)降解和細胞器退化的過程[29]，或使蛋白酪氨酸磷酸酶S亞硝基化，阻斷下游ERK1/2 通路的活化[30]加重神經(jīng)毒性，或上調(diào)線粒體中促凋亡蛋白Bax表達，改變膜通透性，導致鈣離子內(nèi)流，使線粒體 DNA斷裂[31]，激活內(nèi)多聚 ADP核糖合成酶[32]，引起腦內(nèi)儲備能量大量耗竭，繼而激活一系列損傷級聯(lián)反應，最終導致學習記憶障礙。

本次實驗研究表明，通絡醒腦泡騰片能明顯縮短MID模型大鼠的逃避潛伏期，增加逃逸平臺進入次數(shù)，延長中環(huán)滯留時間，提示通絡醒腦泡騰片具有改善MID模型學習記憶能力的作用。與假手術組比較，模型組紅細胞聚集指數(shù)和全血黏度升高，血清iNOS和VEGF含量以及海馬LDH5平均光密度亦顯著增高（P<005），與文獻[10，3335]報道一致，表明一定狀態(tài)下機體存在著自動調(diào)節(jié)的保護性機制；同時通絡醒腦泡騰片能顯著降低模型組的全血黏度，紅細胞聚集指數(shù)，血清iNOS和VEGF含量以及海馬LDH5平均光密度（P<005），其中VEGF與LDH5之間呈現(xiàn)的正相關與文獻理論[20]相符。綜上所述，通絡醒腦泡騰片改善MID模型大鼠學習記憶功能的作用機制與改善外周血液流變學和降低血清iNOS，VEGF的含量及LDH5表達，進而改善腦組織能量供應有關。

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[責任編輯曹陽陽]