王寧，程琦，張延新(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002)

?

黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機(jī)制

王寧，程琦，張延新(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河462002)

摘要：目的探討黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其作用機(jī)制。方法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組,25、50、100 μmol/L黃芩素處理組，分別加入生理鹽水,25、50、100 μmol/L黃芩素處理，采用EdU、MTT、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響，并通過(guò)Western blotting法檢測(cè)黃芩素干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細(xì)胞增殖受到抑制，呈劑量、時(shí)間依賴性；25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細(xì)胞凋亡率依次升高；25、50、100 μmol/L黃芩素處理組SW480細(xì)胞的侵襲遷移能力降低；黃芩素干預(yù)后SW480細(xì)胞中Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 黃芩素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲，并促進(jìn)其凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá)并上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸腫瘤；黃芩素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

結(jié)腸癌已成為世界范圍內(nèi)諸多國(guó)家惡性腫瘤高病死率的原因之一[1]，在發(fā)達(dá)國(guó)家每年影響人數(shù)超過(guò)一百萬(wàn)人[2]。我國(guó)惡性腫瘤患者中，結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均較高[3]。黃芩別名山茶根、土金茶根，歸于唇形科黃芩屬，為多年生草本植物，常以干燥根入藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[4～6]。黃芩素是黃芩根中的主要黃酮類化學(xué)成分，有研究表明黃芩素能抑制人卵巢癌、膠質(zhì)瘤和骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的作用[7,8]。然而有關(guān)黃芩素在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究較少。2014年9月～2015年5月，我們觀察黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)于上海生物研究所，來(lái)源為人結(jié)腸低分化黏液腺癌。黃芩素、MTT 購(gòu)自Sigma公司；EdU檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司； Annexin V-FITC 試劑盒及蛋白提取試劑盒購(gòu)自Calbiochem公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人單克隆Bax、Bcl-2及VEGF抗體購(gòu)自ABCam公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖情況觀察收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設(shè)立空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入100 μL含有濃度為50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基孵育2 h，然后加入100 μL的固定液進(jìn)行固定。按照EdU檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行EdU染色。隨后用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。熒光顯微鏡下觀察并記錄。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，調(diào)整為濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設(shè)立空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加濃度為5 mg/mL的 MTT溶液 10 μL，孵育4 h后終止，振蕩15 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4細(xì)胞凋亡率測(cè)算收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，按照每孔2 mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50、100 μmol/L，設(shè)立空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照說(shuō)明書操作，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5細(xì)胞侵襲遷移能力檢測(cè)進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。將Matrigel稀釋濃度為10 μg/μL后，包被Transwell小室，分隔成上下小室。將不同濃度黃芩素處理48 h后的SW480細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105/mL，取200 μL加入上室，下室加入600 μL的完全培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)10 h。取出Transwell小室，并用PBS濕潤(rùn)，然后用棉球擦去上室表面黏附的細(xì)胞，PBS洗滌2次。將Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，乙醇脫水，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞。

1.6血清Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫印跡Western blotting法檢測(cè)。將濃度為5×104/mL的SW480細(xì)胞懸液以2 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，終濃度分別為25、50、100 μmol/L的黃芩素處理48 h后，棄上清，按蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白提取，并測(cè)定其濃度。50 μg/孔總蛋白上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗滌，Bcl-2、Bax、VEGF、β-actin一抗孵育(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，TBS洗滌3次，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，ECL顯色液顯色檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1黃芩素干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況黃芩素處理24 h后，對(duì)照組、25、50、100 μmol/L每10×視野下黃芩素處理組處于S期的結(jié)腸癌細(xì)胞和該視野下全部細(xì)胞數(shù)比值分別為47/89、45/95、42/90、37/82，與對(duì)照組相比，100 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；經(jīng)黃芩素處理48 h后，對(duì)照組、25、50、100 μmol/L黃芩素處理組每10×視野下黃芩素處理組處于S期的結(jié)腸癌細(xì)胞和該視野下全部細(xì)胞數(shù)比值分別為63/134、42/97、37/91、28/81，與對(duì)照組相比，100 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)。黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，并呈劑量、時(shí)間依賴性。見圖1。

圖1　不同處理組SW480腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2黃芩素干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率對(duì)照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組的細(xì)胞凋亡率分別為(6.71±0.85)%、(7.59±0.94)%、(8.57±0.64)%、(14.14±1.34)%。與對(duì)照組相比，50 μmol/L黃芩素處理組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，100 μmol/L黃芩素處理組的凋亡率明顯高于其他組(P均<0.01)。

2.3黃芩素干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力對(duì)照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組侵襲到下層的細(xì)胞數(shù)分別為(112±11)%、(99±8)%、(90±12)%、(68±14)%。與對(duì)照組相比，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組細(xì)胞遷移數(shù)量分別下降11.61%(P=0.105)、19.64%(P=0.035)、39.29%(P=0.003)。

2.4黃芩素對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax及VEGF表達(dá)的影響對(duì)照組，25、50、100 μmol/L黃芩素處理組中，Bcl-2的表達(dá)量分別為59.87±5.15、58.19±8.34、47.58±4.76、32.20±6.28；Bax表達(dá)量分別為19.68±5.76、31.57±5.83、34.23±6.75、42.47±7.02；VEGF的表達(dá)量分別為39.97±4.85、31.79±9.23、31.13±5.19、17.90±4.33。與對(duì)照組相比，50、100 μmol/L黃芩素處理組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，Bax高于對(duì)照組(P<0.05)；100 μmol/L黃芩素處理組VEGF蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。

3討論

已有研究表明黃芩素可通過(guò)不同途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。黃芩素能抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]；黃芩素及其硫酸化衍生物能通過(guò)依賴ROS途徑誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生凋亡[10]；黃芩素被廣泛用于血液系統(tǒng)的抗腫瘤研究，有一定抗血液系統(tǒng)腫瘤活性[11]；其亦能通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞VEGF和HGF表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡[12];此外黃芩素能抑制人胰腺癌 PANC-1細(xì)胞增殖，影響腫瘤細(xì)胞的偽足形成，導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲力下降[13]。本研究結(jié)果表明黃芩素可通過(guò)抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的DNA合成來(lái)抑制其增殖，并呈劑量、時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明黃芩素能促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡。Transwell小室實(shí)驗(yàn)提示黃芩素還能抑制SW480細(xì)胞的侵襲遷移能力。

Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是參與凋亡進(jìn)程的兩個(gè)蛋白家族，前者負(fù)責(zé)凋亡的執(zhí)行，后者調(diào)控線粒體的完整性[14]。Bcl-2保護(hù)細(xì)胞線粒體的完整性，抑制細(xì)胞色素C的釋放，而Bax在線粒體膜上形成多聚體影響其完整性，使線粒體釋放Caspase活化因子，誘導(dǎo)Caspase引起的細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白家族所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，不單是通過(guò)改變某個(gè)蛋白的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控，而是通過(guò)改變促凋亡和抗凋亡蛋白的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示黃芩素可明顯增加Bax的表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而降低了Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)水平的比例，提示黃芩素促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡可能與以線粒體為核心的凋亡途徑有關(guān)。

VEGF能通過(guò)與VEGF受體結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并形成新生血管，與腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力密切相關(guān)[15]。本研究中SW480經(jīng)黃芩素處理48 h后，與對(duì)照組比較，VEGF蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞增殖能力下降，凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞侵襲遷移能力下降，提示黃芩素可能通過(guò)抑制VEGF表達(dá)，降低SW480細(xì)胞的侵襲遷移能力，進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012[J]. Eur J Cancer, 2013,49(6):1374-1403.

[2] Desantis CE, Lin CC, Mariotto AB, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(4):252-271.

[3] 陳萬(wàn)青，張思維，鄭榮壽，等.中國(guó)2009年惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2013，22(1):2-12.

[4] 崔蓉，孟憲麗，王平，等.黃芩水提取物對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其與膽堿能抗炎通路的相關(guān)性研究[J].中草藥,2012，43(2):321-326.

[5] 趙鐵華，鄧淑華，楊鶴松，等.黃芩莖葉活性部位抗菌作用的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2007，23(7):882-886.

[6] 萬(wàn)巧鳳，顧立剛，殷勝駿，等.黃芩苷對(duì)流感病毒FM1肺炎小鼠肺損傷的保護(hù)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011，26(12):2848-2851.

[7] Kyo R, Nakahata N, Sakakibara I, et al. Baicalin and baicalein, constituents of an important medicinal plant, inhibit intracellular Ca2+elevation by reducing phospholipase C activity in C6 rat glioma cells[J]. J Pharm Pharmacol, 1998,50(10):1179-1182.

[8] Chen J, Li Z, Chen AY, et al. Inhibitory effect of baicalin and baicalein on ovarian cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(3):6012-6025.

[9] 向淼，徐細(xì)明，鄧君健，等.黃芩素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡作用的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012，20(6):1098-1103.

[10] Wang N, Ren D, Deng S, et al. Differential effects of baicalein and its sulfated derivatives in inhibiting proliferation of human breast cancer MCF-7 cells[J]. Chem Biol Interact, 2014,221:99-108.

[11] Chen H, Gao Y, Wu J, et al. Exploring therapeutic potentials of baicalin and its aglycone baicalein for hematological malignancies[J]. Cancer Lett, 2014,354(1):5-11.

[12] 張偉，劉寬浩.黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞VEGF和HGF表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011，38(11):2135-2137.

[13] 任學(xué)群，李宜雄.黃芩素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010，29(3):180-185.

[14] Mcilwain DR, Berger T, Mak TW. Caspase functions in cell death and disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013,5(4):a8656.

[15] Holash J, Maisonpierre PC, Compton D, et al. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF[J]. Science, 1999,284(5422):1994-1998.

Effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells

WANGNing,CHENGQi,ZHANGYanxin

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells and to explore the mechanism. MethodsHuman colorectal cancer cells SW480 in logarithmic phase were randomly divided into the control group, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups which were respectively treated with normal saline, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein. The effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of SW480 cells were detected by EdU, MTT, flow cytometry and Transwell test. The protein expression of Bcl-2, Bax and vascular endothelial growth factor (VEGF) in SW480 cells after the treatment of baicalein was detected by Western blotting.ResultsIn the 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups, the proliferation of SW480 cells was inhibited with a dose and time-dependent manner, the apoptosis rates of SW480 cells were gradually increased, and the invasion abilities of SW480 cells were gradually decreased. After the treatment of baicalein, the expression of Bcl-2 and VEGF in SW480 cells was down-regulated, and the expression of Bax was up-regulated (P<0.05). ConclusionBaicalein inhibits the proliferation and invasion of SW480 cells and promots the apoptosis, which might be related with the down-regulation of Bcl-2 and VEGF expression and the up-regulation of Bax expression.

Key words:colorectal neoplasms; baicalein; cell proliferation; apoptosis; vascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-20)

中圖分類號(hào)：R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0010-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.004

第一作者簡(jiǎn)介：王寧(1983-)，男，碩士，講師，主要研究方向?yàn)槟[瘤病理與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)。E-mail:wntot@126.com

基金項(xiàng)目：河南省教育廳青年教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-269)；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(2010S06)。