楊碩，蘇暢，張永亮,3，李建宇，李靈芝,3(天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；武警后勤學(xué)院；3天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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急性低壓缺氧大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白、MDA、SOD、CAT的表達(dá)變化

楊碩1，蘇暢2，張永亮2,3，李建宇1，李靈芝2,3(1天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2武警后勤學(xué)院；3天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

摘要：目的觀察急性低壓缺氧不同時(shí)點(diǎn)大鼠腦海馬區(qū)細(xì)胞紅蛋白(Cygb)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)表達(dá)的時(shí)序性變化特點(diǎn)。方法 將100只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為常氧對(duì)照組及低壓缺氧6、12、18、24 h組，每組20只。除常氧對(duì)照組外，其他各實(shí)驗(yàn)組大鼠置于低壓缺氧艙內(nèi)建立大鼠急性低壓缺氧模型。采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察各組大鼠腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)改變；采用分光光度法檢測(cè)各組腦組織MDA、SOD、CAT活性。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組腦海馬區(qū)Cygb mRNA表達(dá)。采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組大鼠腦海馬中Cygb的熒光表達(dá)定位及時(shí)序性變化特點(diǎn)。結(jié)果甲苯胺藍(lán)染色顯示隨低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，各缺氧組大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中胞核由藍(lán)色淡染變?yōu)樗{(lán)色深染，胞質(zhì)中Nissl體減少，變成粉狀或消失。與常氧對(duì)照組相比，各缺氧組大鼠腦組織中MDA水平上升，SOD、CAT活性均降低，P均<0.05。免疫熒光化學(xué)染色顯示各缺氧組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中Cygb熒光強(qiáng)度隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。Cygb mRNA表達(dá)隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加(P均<0.05)，且呈時(shí)間依賴性。結(jié)論 急性低壓缺氧大鼠腦海馬區(qū)Gygb表達(dá)、MDA水平升高，SOD、CAT活性降低，且隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而變化。

關(guān)鍵詞：低壓缺氧；細(xì)胞紅蛋白；氧化應(yīng)激；海馬組織；大鼠

研究[1,2]表明，急性缺氧或長(zhǎng)期處于慢性缺氧環(huán)境均可能導(dǎo)致腦組織不可逆性損傷。缺氧可誘導(dǎo)大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白(Cygb)應(yīng)激性增加，對(duì)腦缺氧損傷起保護(hù)作用[3，4]。但目前尚未見關(guān)于急性低壓缺氧后腦海馬區(qū)Cygb的表達(dá)定位、時(shí)序性變化及其與損傷關(guān)系的研究報(bào)道。2015年2～9月，我們建立大鼠急性低壓缺氧模型，通過組織學(xué)觀察、大鼠腦組織丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及海馬區(qū)Cygb檢測(cè)，研究大鼠腦海馬組織的缺氧損傷情況及Cygb表達(dá)水平變化，探討Cygb與高原缺氧性腦損傷的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料藥品與儀器：考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒、CAT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程公司)；山羊抗Cygb多克隆抗體(santa cruz)、正常兔血清、TRITC標(biāo)記兔抗山羊IgG(北京中杉生物有限公司)；抗熒光衰減封片劑(北京Applygen公司)；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒、DL-2000 Markers(寶生物工程有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen公司，美國)。數(shù)控低壓缺氧艙(煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)有限公司)；高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；超低溫冰箱(Sanyo公司，日本)；組織切片機(jī)(Leica公司，德國)；E-510型多功能顯微鏡(Olympus公司，日本)。動(dòng)物：體質(zhì)量290～320 g清潔級(jí)成年雄性SD大鼠100只(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2急性低壓缺氧損傷模型的建立及分組運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將100只大鼠隨機(jī)分為5組，分別設(shè)為常氧對(duì)照組、低壓缺氧6 h組、低壓缺氧12 h組、低壓缺氧18 h組和低壓缺氧24 h組，每組20只。飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境。除常氧對(duì)照組外，各組大鼠均入艙進(jìn)行低壓缺氧。調(diào)節(jié)艙內(nèi)壓力在20 min內(nèi)降至真空度-0.06 MPa(相當(dāng)于海拔7 000 m大氣壓力)。實(shí)驗(yàn)過程中維持氧水平為(10±2)%，溫度為(20±3)℃，濕度為(65±5)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后20 min內(nèi)使缺氧艙內(nèi)升至正常氣壓。常氧對(duì)照組大鼠相同溫度、濕度下于艙外正常飼養(yǎng)。

1.3各組大鼠腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠出艙后迅速于冰浴下斷頭取腦組織，用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，取海馬區(qū)腦組織石蠟包埋，連續(xù)切片，甲苯胺藍(lán)染色，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA含量檢測(cè)各組大鼠出艙后迅速于冰浴下斷頭取腦，剝除腦膜并用預(yù)冷的PBS沖凈表面血液。吸干表面水分稱重，冰浴下加PBS勻漿，離心10 min(4 ℃、3 000 r/min)，吸取上清，按試劑盒說明書方法檢測(cè)樣品SOD、CAT活性及MDA水平，同時(shí)測(cè)定樣品蛋白水平。

1.5各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中Cygb熒光強(qiáng)度檢測(cè)采用免疫熒光染色。將石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，PBS漂洗，加0.4%胃蛋白酶37 ℃下孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗、吹干，滴加10%兔血清室溫孵育30 min，滴加50 μL兔抗大鼠Cygb IgG多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜。室溫放置30 min后用0.01 mol/L PBS漂洗。避光下滴加TFITC標(biāo)記的羊抗兔抗體50 μL(1∶100)，于37 ℃孵育45 min，0.01 mol/L PBS漂洗。加抗熒光衰減封片劑封片，4 ℃避光保存。空白對(duì)照用PBS代替一抗，其他處理相同。以568 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，617 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝像。Cygb陽性細(xì)胞顯示紅色熒光。

1.6Cygb mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。取大鼠海馬區(qū)腦組織約100 mg，提取總RNA，分別采用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA水平和RNA完整性。按試劑盒說明合成cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為81 bp[5]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像分析系統(tǒng)分析，計(jì)算各組Cygb擴(kuò)增帶的吸光度(Af)與β-actin擴(kuò)增帶的吸光度(Ab)間的比值。

2結(jié)果

2.1各組甲苯胺藍(lán)染色組織形態(tài)學(xué)變化常氧對(duì)照組大鼠腦海馬各區(qū)細(xì)胞形態(tài)完整，胞核呈藍(lán)色淡染，胞質(zhì)中可見大量深藍(lán)色的粗顆粒狀Nissl體。低壓缺氧6 h組大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈藍(lán)色深染，CA2、CA3、CA4區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷逐漸減輕，呈藍(lán)色淡染，Nissl體減少或消失。缺氧12、18和24 h組：大鼠腦海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈不規(guī)則狀稀疏排列，大部分細(xì)胞胞核破碎，細(xì)胞均藍(lán)色深染，且Nissl體幾乎全部消失；損傷隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重，且海馬各區(qū)的損傷程度以CA1區(qū)最為嚴(yán)重，CA2、CA3及CA4區(qū)損傷逐漸減輕。

2.2各組SOD、CAT活性及MDA水平變化與常氧對(duì)照組相比，各低壓缺氧組大鼠腦組織中SOD、CAT活性均降低(P均<0.01)，且隨低壓缺氧損傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸遞減。與常氧對(duì)照組相比，缺氧12 h組大鼠腦組織MDA水平開始明顯上升(P<0.05)，缺氧18 h組和24 h組MDA水平升高更顯著(P均<0.01)。見表1。

表1　　　　各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA水平

注：與常氧對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與低壓缺氧6 h組相比,#P<0.05,##P<0.01;與低壓缺氧12 h組相比,△△P<0.01;與低壓缺氧18 h組相比,▲▲P<0.01。

2.3各組免疫熒光染色結(jié)果在大鼠腦海馬組織中，Cygb免疫熒光陽性表達(dá)細(xì)胞呈紅色熒光。常氧對(duì)照組Cygb在大鼠腦海馬各區(qū)中均有微弱表達(dá)，部分海馬錐形細(xì)胞胞核和胞質(zhì)中可見陽性信號(hào)出現(xiàn)，且主要集中于核膜和核仁周圍呈不規(guī)則分布；低壓缺氧6 h組Cygb表達(dá)增加，且在軸突及樹突中也有陽性信號(hào)出現(xiàn)；缺氧12 h組海馬區(qū)大部分神經(jīng)細(xì)胞皺縮變形，胞核固縮或破裂，Cygb表達(dá)進(jìn)一步增加；缺氧18 h和24 h組中大量錐形細(xì)胞壞死和凋亡，胞核破碎或溶解，但仍可見Cygb在胞質(zhì)及胞核區(qū)表達(dá)顯著增加。

2.4各組Cygb mRNA表達(dá)比較隨低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腦海馬組織中Cygb mRNA的表達(dá)逐漸增高，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性；常氧對(duì)照組中Cygb mRNA呈低表達(dá)，與之相比，低壓缺氧損傷6 h組Cygb mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，低壓缺氧12 h、18 h及24 h組Cygb mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高(P均<0.01)。見表2。

表2　　　　各組大鼠腦海馬組織中Cygb mRNA表達(dá)

注：與常氧對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與低壓缺氧6 h組相比,##P<0.01;與低壓缺氧12 h組相比,△△P<0.01;與低壓缺氧18 h組相比,▲P<0.05。

3討論

Iswar等[6]研究表明，缺氧會(huì)影響大鼠腦學(xué)習(xí)和記憶功能。Mishra等[7]研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶等功能的海馬體對(duì)缺氧性損傷比腦皮質(zhì)更為敏感。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧6 h組神經(jīng)細(xì)胞受損較輕，主要表現(xiàn)為Nissl體減少或消失。隨著缺氧時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度逐漸加重，均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞質(zhì)藍(lán)色深染，Nissl體完全消失。且海馬各區(qū)損傷程度不同，以CA1區(qū)損傷最嚴(yán)重，CA2、CA3及CA4區(qū)損傷程度逐漸減輕，這可能是因?yàn)镃A1區(qū)是海馬體對(duì)缺氧最為敏感的部位[8]。

正常細(xì)胞內(nèi)存在自由基的清除系統(tǒng)，常見的自由基清除系統(tǒng)主要有SOD、CAT等。SOD是清除系統(tǒng)的第一道防線，可將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2或其他氫過氧化物。CAT和其他酶共同組成第二道防線，其作用是清除過氧體系中產(chǎn)生的H2O2。因而測(cè)定腦組織中SOD、CAT活性可作為氧自由基生成量的間接指標(biāo)[3]。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，細(xì)胞中可產(chǎn)生大量氧自由基，過量的氧自由基可激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，并形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA)，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。腦組織MDA的水平可間接反映低壓缺氧時(shí)腦組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[9,10]。通過檢測(cè)腦組織中SOD、CAT活性和MDA水平可間接反映低壓缺氧導(dǎo)致的大鼠腦損傷程度。本研究證實(shí)，低壓缺氧可致大鼠腦組織SOD和CAT活性降低，且呈時(shí)間依賴性，與之相反，各缺氧組大鼠腦組織MDA水平與對(duì)照組相比均明顯升高，且隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，與腦組織病理學(xué)改變一致。提示急性低壓缺氧可引起腦組織氧自由基蓄積，破壞自由基清除系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)大鼠腦損傷。

Cygb是攜氧球蛋白家族成員，具有儲(chǔ)存和傳遞氧氣的功能[11]。Schmidt 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)在腦組織某些特定區(qū)域中能觀察到Cygb表達(dá)，提示Cygb可能與腦缺氧密切相關(guān)。Avivi等[12]的研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導(dǎo)鼴形鼠腦組織Cygb表達(dá)上調(diào)，可能對(duì)腦缺氧損傷起到保護(hù)作用。本研究證實(shí)缺氧后大鼠腦組織Cygb mRNA水平明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)結(jié)果相符，提示Cygb在保護(hù)低壓缺氧性腦損傷中起著重要作用。隨后通過免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn)，常氧條件下，大鼠腦海馬組織神經(jīng)細(xì)胞胞核和胞質(zhì)內(nèi)均有少量Cygb表達(dá)，且主要集中于核仁及核膜周圍；隨低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)Cygb表達(dá)明顯增強(qiáng)，且遍布于細(xì)胞胞核、胞質(zhì)及突起中，提示Cygb作為攜氧球蛋白不僅能在細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，亦可能作為一種核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移入胞核，從而調(diào)控其他基因的表達(dá)。

綜上所述，低壓缺氧可誘導(dǎo)大鼠腦組織海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Nissl體減少或消失，破壞自由基清除系統(tǒng)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致低壓缺氧性腦損傷，且損傷程度隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)加劇；Cygb表達(dá)的時(shí)序性變化特點(diǎn)提示其可能對(duì)急性低壓缺氧性腦損傷起到保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rupp T, Jubeau M, Lamalle L, et al. Cerebral volumetric changes induced by prolonged hypoxic exposure and whole-body exercise [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014,34(11):1802-1809.

[2] Moore LG, Harrison GL, McCullough RE, et al. Low acute hypoxic ventilator response and hypoxic depression in acute altitude sickness[J]. J Appl Physiol, 1986,60(4):1407-1412.

[3] Fordel E, Geuens E, Dewilde S, et al. Hypoxia/ischemia and the regulation of neuroglobin and cytoglobin expression[J]. IUBMB Life, 2004,56(11-12):681-687.

[4] Geuens E, Brouns I, Flamez D, et al. A globin in the nucleus. J Biol Chem, 2003,278(33):30417-30420.

[5] Schmidt M, Gerlach F, Avivi A, et al. Cytoglobin is a respiratory protein in connective tissue and neurons, which is up-regulated by hypoxia[J]. J Biol Chem, 2004,279(9):8063-8069.

[6] Iswar B, Satya ND, Vishal J. Corticosterone synthesis inhibitor metyrapone ameliorates chronic hypobaric hypoxia induced memory impairment in rat [J]. Behavioural Brain Res, 2012, 228(1): 53-65.

[7] Mishra OP, Delivoria-Papadopoulos M. Cellular mechanisms of hypoxic injury in the developing brain[J]. Brain Res Bull, 1999,48(3):233-238.

[8] Kihara S, Shiraishi T, Nakagawa S, et al. Visualization of DNA double strand breaks in the gebil hippocampus CA1 following transient ischemia[J]. Neurosci Let, 1994,175(1-2):133-136.

[9] Chauhan N, Zhao ZH, Barber PA, et al. Lessons in experimental ischemia for clinical stroke medicine[J]. Curr Opin Neurol, 2003,16(1):65-71.

[10] Roesner A, Hankeln T, Burmester T. Hypoxia induces a complex response of globin expression in zebrafish (Danio rerio) [J]. J Exp Biol, 2006,209(11):2129-2137.

[11] Burmester T, Ebner B, Weich B, et al. Cytoglobin: A Novel Globin Type Ubiquitously Expressed inVertebrate Tissues[J]. Mol Biol Evol, 2002,19(4):416-421.

[12] Avivi A, Gerlach F, Joel A, et al. Neuroglobin, cytoglobin, and myoglobin contribute to hypoxia adaptation of the subterranean mole rat Spalax[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(50):21570-21575.

(收稿日期：2015-11-05)

中圖分類號(hào)：R651.15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.011

通信作者：李靈芝(E-mail：13682196000@163.com)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471823)；天津市重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(12JCZDJC34700)；武警后勤學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(WHTD201303)。